【摘要】：第一部分熊果酸(Ursolic acid, UA)對(duì)胰島素和亮氨酸刺激mTOR信號(hào)的影響 目的：(1)探討UA對(duì)C2C12肌原細(xì)胞和分化成熟的C2C12肌管細(xì)胞中胰島素刺激mTOR信號(hào)的影響；(2)探討UA對(duì)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素刺激mTOR信號(hào)的影響；(3)探討UA對(duì)C2C12肌原細(xì)胞和分化成熟的C2C12肌管細(xì)胞中亮氨酸刺激mTOR信號(hào)的影響；(4)探討UA對(duì)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞中亮氨酸刺激mTOR信號(hào)的影響。 方法：(1)血清饑餓的C2C12肌原細(xì)胞和分化成熟的C2C12肌管細(xì)胞分別被給予不同濃度的UA干預(yù)60分鐘,跟隨10nM胰島素共處理10分鐘,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)；(2)血清饑餓的分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞分別被給予不同濃度的UA干預(yù)60分鐘,跟隨10nM胰島素共處理10分鐘,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)；(3)血清饑餓的C2C12肌原細(xì)胞和分化成熟的C2C12肌管細(xì)胞分別被給予不同濃度的UA干預(yù)60分鐘,跟隨10mM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)；(4)血清饑餓的分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞分別被給予不同濃度的UA干預(yù)60分鐘,跟隨10mmM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果：(1)與對(duì)照組相比,UA呈劑量依賴性抑制C2C12肌原細(xì)胞和分化成熟的C2C12肌管細(xì)胞中胰島素對(duì)S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的誘導(dǎo)；(2)與對(duì)照組相比,UA呈劑量依賴性抑制分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素對(duì)S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的誘導(dǎo)；(3)與對(duì)照組相比,UA呈劑量依賴性抑制C2C12細(xì)胞和分化成熟C2C12肌管細(xì)胞中亮氨酸對(duì)S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的誘導(dǎo)；(4)與對(duì)照組相比,UA呈劑量依賴性抑制分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞中亮氨酸對(duì)S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的誘導(dǎo)。 結(jié)論：UA抑制C2C12細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素和亮氨酸對(duì)S6K和4E-BP1磷酸化水平的誘導(dǎo)。 第二部分PI3K/Akt途徑在UA抑制胰島素和亮氨酸刺激mTOR信號(hào)中的作用 目的：(1)探討PI3K/Akt途徑是否參與UA對(duì)胰島素刺激mTOR信號(hào)的抑制；(2)探討PI3K/Akt途徑是否參與UA對(duì)亮氨酸刺激mTOR信號(hào)的抑制。 方法：(1)無(wú)血清培養(yǎng)C2C12細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞,分別給予不同濃度的UA預(yù)處理60分鐘,跟隨用或不用10nM胰島素共處理10分鐘,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Akt在Thr308和Ser473的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)；(2)無(wú)血清培養(yǎng)C2C12肌原細(xì)胞,用或不用100nM Wortmannin預(yù)處理60分鐘,跟隨50μM UA共處理60分鐘,然后用或不用10nM Insulin處理10分鐘,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)S6K在Thr389,4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及Akt在Thr308的磷酸化水平和蛋白質(zhì)表達(dá)；(3)無(wú)血清培養(yǎng)C2C12細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞,分別給予不同濃度的UA干預(yù)60分鐘,跟隨10mM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Akt在Thr308和Ser473的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)；(4)無(wú)血清培養(yǎng)PDK1knockout(KO)/wildtype(WT) MEFs細(xì)胞,用或不用50μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨用或不用10mM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果：(1)UA處理明顯抑制C2C12細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素對(duì)Akt在Thr308和Ser473磷酸化水平的誘導(dǎo)；(2)P13K抑制劑Wortmannin明顯抑制C2C12肌原細(xì)胞中胰島素對(duì)S6K在Thr389、4E-BP1在Thr37/46及Akt在Thr308的磷酸化水平的誘導(dǎo),但UA對(duì)其S6K和4E-BP1磷酸化水平不具有進(jìn)一步的抑制效應(yīng)；(3)熊果酸和亮氨酸對(duì)C2C12細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞中Akt的磷酸化水平?jīng)]有明顯影響；(4)亮氨酸明顯誘導(dǎo)PDK1KO/WTMEFs細(xì)胞中S6K在Thr389的磷酸化水平,UA處理明顯抑制了亮氨酸對(duì)PDK1KO/WT MEFs細(xì)胞中S6K在Thr389磷酸化水平的誘導(dǎo)。 結(jié)論：UA主要通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路而抑制胰島素對(duì)mTOR活性的誘導(dǎo)；UA抑制亮氨酸對(duì)mTOR活性的誘導(dǎo)不依賴于PI3K/Akt信號(hào)通路。 第三部分TSC1/2-Rheb信號(hào)通路和mTOR與Raptor/Deptor相互作用在UA抑制亮氨酸刺激mTOR激活中的作用 目的：(1)探討UA是否通過(guò)TSC1/2依賴性抑制亮氨酸對(duì)mTOR活性的誘導(dǎo)；(2)探討UA抑制亮氨酸誘導(dǎo)的mTOR激活是否依賴于Rheb;(3)探討UA是否通過(guò)影響mTORC1蛋白質(zhì)表達(dá)而抑制亮氨酸刺激的mTOR激活；(4)探討UA是否通過(guò)影響mTOR與Raptor/Deptor相互作用而抑制亮氨酸對(duì)mTOR信號(hào)的激活作用。 方法：(1)無(wú)血清培養(yǎng)TSC1/2KO/WTMEFs細(xì)胞,給予50μMUA預(yù)處理60分鐘,跟隨用或不用10mM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)S6K在Thr389和4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)；(2)無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)照質(zhì)粒、RhebWT和Rhebs16H過(guò)表達(dá)的C2C12細(xì)胞,給予50μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨10mM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)S6K在Thr389的磷酸化水平及蛋白質(zhì)表達(dá)；(3)無(wú)血清培養(yǎng)Deptor沉默的和對(duì)照的C2C12細(xì)胞,給予50μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨用或不用10mM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)S6K在Thr389的磷酸化水平；(4)無(wú)血清培養(yǎng)C2C12細(xì)胞,給予50μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨用或不用10mM亮氨酸共處理60分鐘,使用抗mTOR抗體免疫沉淀mTOR,通過(guò)Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mTOR,Raptor, Deptor和Tubulin水平以及免疫沉淀物中mTOR, Raptor和Deptor的水平。 結(jié)果：(1)TSC1/2敲除明顯增加S6K在Thr389磷酸化水平,亮氨酸處理進(jìn)一步增加TSCl/2敲除的MEFs細(xì)胞中S6K磷酸化水平,UA明顯抑制TSCl/2敲除的MEFs細(xì)胞中亮氨酸對(duì)S6K磷酸化的誘導(dǎo)；(2)C2C12細(xì)胞中RhebWT和Rhebs16H過(guò)表達(dá)明顯增加S6K在Thr389的磷酸化水平,亮氨酸進(jìn)一步促進(jìn)這些細(xì)胞中S6K磷酸化水平,盡管UA沒(méi)有抑制RhebWT和Rhebs16H過(guò)表達(dá)引起的S6K磷酸化增加,但是它抑制了亮氨酸對(duì)S6K磷酸化的誘導(dǎo)；(3) Deptor敲減明顯增加S6K在Thr389的磷酸化水平,但亮氨酸處理進(jìn)一步增加Deptor敲減的C2C12細(xì)胞中S6K磷酸化水平,UA明顯抑制亮氨酸對(duì)Deptor敲減的C2C12細(xì)胞中S6K磷酸化水平的誘導(dǎo)；(4)UA沒(méi)有影響C2C12細(xì)胞中mTOR, Raptor和Deptor等蛋白質(zhì)的表達(dá),UA沒(méi)有干擾mTOR與Raptor/Deptor之間的相互作用。 結(jié)論：UA抑制亮氨酸刺激的mTOR激活不依賴TSC1/2-Rheb通路；UA不通過(guò)影響mTORC1蛋白質(zhì)表達(dá)和mTOR與Raptor/Deptor之間相互作用而抑制亮氨酸對(duì)mTOR信號(hào)的誘導(dǎo)。 第四部分RagB在UA抑制亮氨酸刺激mTOR激活中的作用 目的：(1)探討RagB是否介導(dǎo)UA對(duì)亮氨酸刺激mTOR信號(hào)的抑制；(2)探討UA是否影響RagB與Raptor之間的相互作用；(3)探討UA是否抑制mTOR在溶酶體中的定位。 方法：(1)無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)照質(zhì)粒、RagBWT和RagBQ99L過(guò)表達(dá)的C2C12細(xì)胞,分別給予50μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨10mM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)S6K在Thr389的蛋白質(zhì)表達(dá)和磷酸化水平；(2)無(wú)血清培養(yǎng)RagB沉默的和對(duì)照的C2C12細(xì)胞,給予501μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨10mmM亮氨酸共處理60分鐘,Western Blot檢測(cè)S6K在Thr389的磷酸化水平和蛋白質(zhì)表達(dá)；(3)無(wú)血清培養(yǎng)RagB過(guò)表達(dá)的C2C12細(xì)胞,給予50μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨用或不用10mM亮氨酸共處理60分鐘,細(xì)胞通過(guò)交聯(lián)劑DSP處理,免疫沉淀Raptor,使用Western Blot檢測(cè)免疫沉淀物中Raptor和RagB的水平；(4)無(wú)血清培養(yǎng)RagB過(guò)表達(dá)的C2C12細(xì)胞,給予50μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨10mM亮氨酸共處理60分鐘,細(xì)胞通過(guò)交聯(lián)劑DSP處理,免疫沉淀Flag-RagB, Western Blot檢測(cè)免疫沉淀物中Flag-RagB和Raptor的表達(dá)；(5)無(wú)血清培養(yǎng)C2C12細(xì)胞,給予50μM UA預(yù)處理60分鐘,跟隨10mM亮氨酸共處理60分鐘,細(xì)胞用抗mTOR和抗LAMP1抗體孵育,共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察mTOR在溶酶體中的定位。 結(jié)果：(1) RagBWT過(guò)表達(dá)對(duì)S6K磷酸化水平?jīng)]有明顯影響,但增強(qiáng)了亮氨酸對(duì)S6K在Thr389磷酸化的誘導(dǎo),UA明顯抑制了亮氨酸對(duì)mTORCl活性的誘導(dǎo)；RagBQ99L明顯促進(jìn)基礎(chǔ)水平的S6K磷酸化,但亮氨酸處理沒(méi)有進(jìn)一步增強(qiáng)S6K磷酸化水平,UA明顯抑制RagBQ99L過(guò)表達(dá)細(xì)胞中S6K磷酸化水平；(2)UA對(duì)RagB沉默的C2C12細(xì)胞中亮氨酸刺激的mTOR信號(hào)沒(méi)有明顯影響；(3)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示亮氨酸明顯促進(jìn)RagB與Raptor之間的相互作用,UA明顯抑制這種相互作用；(4)共聚焦免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示亮氨酸增加mTOR與溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1的共定位,UA的處理抑制了mTOR與LAMP1的共定位。 結(jié)論：RagB介導(dǎo)UA對(duì)亮氨酸誘導(dǎo)mTOR信號(hào)的抑制；UA通過(guò)干擾RagB與Raptor之間的相互作用并阻止mTOR在溶酶體中的定位而抑制亮氨酸刺激mTOR的激活。
【圖文】：

文 第第二章結(jié)果量依賴性抑制C2C12細(xì)胞中胰島素對(duì)S6K和4E-BP1蛋白磷導(dǎo)餓的C2C12肌原細(xì)胞和肌管細(xì)胞分別被給予不同濃度的UA用或不用lOnM的胰島素共處理10分鐘，Western Blot檢測(cè)蛋白S6K在Thr389及4E-BP1在Thr37,46的a愃嶧郊八槍允荊琔A呈劑量依賴性抑制細(xì)胞內(nèi)S6K和4E-BP1的磷酸化度抑制效果最明顯（圖1-1至1-4)。

饑餓的C2C12肌原細(xì)胞和肌管細(xì)胞分別被給予不同濃度的UA干預(yù)60隨用或不用lOnM的胰島素共處理10分鐘，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游蛋白S6K在Thr389及4E-BP1在Thr37,46的a愃嶧郊八塹牡鞍捉峁允荊琔A呈劑量依賴性抑制細(xì)胞內(nèi)S6K和4E-BP1的磷酸化水平，濃度抑制效果最明顯（圖1-1至1-4)。IIIIIIHHII —-- P-S6K Thr389mm mm m 9m _|s6kmm 4 ? P-4E-BP1 Thr 遍管著，，

本文編號(hào)：2669310