【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)屬于副粘病毒科肺病毒屬,是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道感染的最常見病原體之一。在美國,據(jù)統(tǒng)計,每年有85000～144000的嬰兒因病毒性肺炎或毛細(xì)支氣管炎接受住院治療。除此之外,某些老年人群和免疫功能缺陷的成年人群也是RSV感染的主要對象。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)顯示,全球每年的呼吸道合胞病毒感染者約有6400萬例,而其中16萬例因感染并發(fā)癥死亡。經(jīng)過幾十年的努力,到目前為止依舊沒有安全、有效的疫苗可用于RSV感染的預(yù)防。因此,建立簡單、快速、靈敏的RSV實驗室檢測方法,對疾病的早期診斷、治療以及預(yù)防控制都具有非常重要的意義。 呼吸道合胞病毒的檢測方法主要基于三個方面：一是病毒的分離培養(yǎng)；二是病毒核酸的檢測,三是病毒抗原或抗體的分析。雖然用組織培養(yǎng)分離病毒是目前診斷的最好方法或稱為金標(biāo)準(zhǔn),但是培養(yǎng)周期長,敏感性差,操作復(fù)雜,不適于大量檢測。而病毒核酸檢測方法靈敏度高、快速,并且能同時分析大批量樣本,但卻需要價格昂貴的精密儀器和專業(yè)的技術(shù)人員操作,不適于普通實驗室或戶外檢測。免疫檢測技術(shù)因其特異性強、方法簡單等優(yōu)勢,在病毒抗原或抗體的檢測中得到廣泛的應(yīng)用。不過,由于靈敏度低,很難用于臨床RSV感染的早期診斷。為了解決上述問題,以實現(xiàn)RSV的高靈敏、簡操作、低成本、可視化分析,本文將貴金屬納米顆粒及金/石墨烯納米復(fù)合物引入免疫分析技術(shù),建立了一系列高靈敏的RSV檢測新方法。具體的研究工作如下： 1.金銀納米顆粒在RSV免疫分析中的應(yīng)用 (1)利用酶反應(yīng)產(chǎn)物作為信號分子的表面增強拉曼散射(SERS)免疫分析。銀納米顆粒(AgNPs)是常用的表面增強拉曼散射(SERS)活性基底。本文利用抗壞血酸及檸檬酸共還原氯化銀溶膠法制得分散性好且SERS活性強的AgNPs,并將其用于RSV的免疫分析中。在該免疫學(xué)反應(yīng)體系中,辣根過氧化物酶(HRP)在H2O2存在下催化底物TMB失去電子,得到氧化產(chǎn)物TMB+。溶液中成離子狀態(tài)的TMB+與帶負(fù)電AgNPs發(fā)生相互作用,化合物被吸附到AgNPs表面,產(chǎn)生強烈的SERS信號,實現(xiàn)對RSV的靈敏檢測。相較于傳統(tǒng)的ELISA顯色法,靈敏度提高50倍。另外,由于酶催化TMB顯色反應(yīng)被廣泛用于生化分析領(lǐng)域,因此利用酶反應(yīng)產(chǎn)物的SERS分析策略具有普適性。 (2)金納米粒子信號放大高靈敏度的檢測RSV。金納米粒子(AuNPs)因具有合成簡單、比表面積大、負(fù)載效率高、性能穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于生化分析領(lǐng)域。本文利用AuNPs作為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體的載體,以HRP催化H2O2氧化TMB的吸光度值來檢測RSV。由于AuNPs較大的比表而積可以增加酶標(biāo)抗體在其表面的吸附量,所以同傳統(tǒng)的ELISA相比,檢測信號增強,最低檢出濃度可以達(dá)到0.5pg/mL。另外該方法重復(fù)性好,選擇性強,構(gòu)建的免疫體系在3個星期內(nèi)都能夠穩(wěn)定存在,具有很好的應(yīng)用價值。 (3)結(jié)合金納米層(GNPL)修飾的微孔板及酪胺信號放大(TSA)技術(shù),建立雙信號放大策略實現(xiàn)對RSV的高靈敏檢測。在H2O2存在時,一些氧化酶(辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)可以將底物酪胺催化后共價結(jié)合到周圍蛋白的富電子表面形成酪胺化復(fù)合物,大量富集成以酶為中心的類似“樹”狀的聚集團(tuán),當(dāng)對酪胺進(jìn)行一定標(biāo)記后,可以將原始信號幾何級放大。本文以RSV為代表,首先采用化學(xué)鍍金的方式在微孔板表面制備金納米層,改善微孔對捕獲抗體的吸附能力,提高檢測靈敏度；再利用TSA技術(shù)使HRP大量沉積,催化底物TMB顯色,進(jìn)一步放大檢測信號,實現(xiàn)RSV的高靈敏度分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),方法在0.05～30pg/mL范圍之間對RSV的響應(yīng)具有良好的線性關(guān)系。另外,將RSV分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和人血清,回收率在90.6%～98.1%,說明該方法可用于復(fù)雜樣品中RSV的分析測定。 2.金/石墨烯復(fù)合納米材料在RSV免疫分析中的應(yīng)用 (1)利用Hg2+增強AuNPs/graphene模擬酶活性實現(xiàn)對RSV的色度免疫分析。據(jù)報道,納米材料包括碳納米材料、貴金屬納米顆粒、氧化鐵納米顆粒等都具有類似過氧化物酶的催化活性,即在H2O2存在下,能夠催化TMB等辣根過氧化物酶的底物發(fā)生氧化反應(yīng),產(chǎn)生顏色變化。但是當(dāng)有生物分子比如蛋白質(zhì)、DNA吸附后,催化活性被完全抑制,限制了這類納米材料在分析化學(xué)中的應(yīng)用。本研究通過鞣酸一步合成AuNPs/graphene復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物具有模擬酶的性質(zhì),添加Hg2+可以顯著增強其酶活性,即使是生物分子完全抑制其催化能力后。基于此,建立RSV的色度免疫分析新方法。實驗結(jié)果表明,當(dāng)RSV濃度在0.1～10pg/mL的濃度范圍內(nèi)時,吸收值與RSV濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,最低檢出濃度為0.04pg/mL。 (2)利用石墨烯和羥胺還原放大技術(shù),建立超靈敏的等離子免疫分析方法用于病原體的檢測。Graphene由于具有高的表面積,大量的金納米粒子可以在其表面沉積；同時因為金納米顆粒能高效催化HAuCl4-NH2OH氧化還原反應(yīng),使Au原子沉積到AuNPs表面,導(dǎo)致AuNPs的尺寸由小變大。基于此,建立一種超靈敏的RSV等離子免疫分析方法。首先,通過簡單的水熱法一步合成AuNPs/graphene納米復(fù)合物,利用AuNPs和graphene均易吸附蛋白的優(yōu)點,將抗體修飾于AuNPs/graphene雜合體表面,并加入由固相載體-RSV組成的微孔中形成三明治結(jié)構(gòu),此時加入HAuCl4-NH2OH溶液,微孔溶液的顏色發(fā)生變化,通過肉眼便可讀出結(jié)果,特別適合于資源有限的地區(qū)。 總之,本論文以金銀納米顆�；蚪�/石墨烯復(fù)合納米材料的優(yōu)良性能建立了一系列RSV免疫分析新方法,不僅進(jìn)一步拓寬了金銀納米材料在免疫分析中的應(yīng)用,同時也為RSV感染的早期診斷以及治療方案的合理選擇都提供了新思路。
【圖文】：

圖1.1 RSV結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1.1 Scheme of the RSV virion.RSV核酸為非節(jié)段性單股負(fù)鏈RNA,有包膜。從病毒結(jié)構(gòu)來看，主要分為三層，內(nèi)層為病毒核衣殼，由核蛋白N和RNA組成，除此之外，還應(yīng)包括RNA依賴的RNA聚合酶，磷蛋白P和M2-1蛋白；中層為基質(zhì)蛋白，，構(gòu)成病毒的外殼骨

圖1.2分子燈標(biāo)修飾的AuNPs用于活細(xì)胞內(nèi)mRNA的分析Figure 1.2 Hairpin DNA functionalized gold nanoparticles (hAuNPs) for detection ofmRNA in live cells.1.2.5納米材料及其特性
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.14;O657.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 葉春潔;趙玉云;陳嶸;蔣興宇;;金納米粒子與蛋白質(zhì)的相互作用及其應(yīng)用[J];中國科學(xué):化學(xué);2012年12期

本文編號：2669090