【摘要】：新生兒缺氧缺血腦病(hypoxia-ischemic encephalopathy,HIE)是圍產(chǎn)期新生兒缺血缺氧引起的腦損傷疾病,是致使新生兒死亡和導致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因之一,存活者多出現(xiàn)智力發(fā)育低下、運動發(fā)育遲緩、腦性癱瘓、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)。因此,及時有效的治療對于HIE患兒及其家庭意義重大。近年來,在治療HIE方面,通過運用針刺、艾灸、穴位注射、小兒推拿、中藥口服、熏蒸等中醫(yī)療法成效斐然,特別是針刺療法,在治療HIE后遺癥方面,療效極為顯著。目的:以BNIP3介導的線粒體自噬保護通路作為切入點,建立缺血缺氧腦損傷(Hypoxia-ischemic brain damage,HIBD)大鼠模型,選擇靳三針頭部穴組(腦三針、顳三針、智三針)應用針刺干預,同時加入自噬激活劑雷帕霉素,通過免疫印跡等生物檢測技術(shù)觀察自噬相關蛋白NIX(Nip3-like protein X/adenovirus 19kDa interacting protein 3-like)、B 細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)的表達變化,旨在探討針刺對缺氧缺血誘導的受損神經(jīng)元中線粒體自噬水平的影響和作用機制,有利于為臨床治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxia ischaemic encephalopathy,HIE)提供新的思路和依據(jù)。方法:SPF級SD雌鼠20只,雄鼠10只,按1:1合攏配種,成功配種得孕鼠16只,剖宮產(chǎn)大鼠8只,代乳鼠8只,經(jīng)異氟烷麻醉后剖宮產(chǎn)術(shù),鉗夾雙側(cè)子宮動脈10min,不超過30S,將無菌紗布蓋于雙側(cè)子宮上,鉗夾時間結(jié)束后,取出新生大鼠,立即、搶救,共得66只仔鼠,其余鼠淘汰。按隨機數(shù)字表法,每組11只,分為模型組、針刺組、激活劑組、抑制劑組、針刺加激活劑組、針刺加抑制組。在HIBD模型大鼠出生第14天開始干預,每天干預一次,連續(xù)干預14天。通過免疫印跡等生物檢測技術(shù)觀察自噬相關蛋白NIX、Bcl-2的表達變化,結(jié)果:通過剖腹后鉗夾雙側(cè)子宮動脈制造宮內(nèi)窘迫子代鼠模型,HE染色結(jié)果:模型組大鼠腦部海馬區(qū)神經(jīng)細胞排列散亂,可見腫脹的神經(jīng)元,結(jié)構(gòu)疏松,神經(jīng)元部分出現(xiàn)核固縮、深染及神經(jīng)元細胞空泡化。針刺組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)正常,細胞核清晰,核仁明顯。抑制劑組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)被破壞更為嚴重,可見較多變性壞死的神經(jīng)細胞,結(jié)構(gòu)疏松,細胞間隙增寬,核固縮、深染,部分神經(jīng)元胞核消失,空泡化。較抑制劑組,針刺加抑制劑組海馬神經(jīng)細胞形態(tài)破壞稍有改善,細胞結(jié)構(gòu)較前緊密,間隙變窄,但神經(jīng)元仍存在腫脹現(xiàn)象,細胞邊界欠光滑。相反,激活劑組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞排列致密,神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整,細胞邊界清晰光滑。針刺加激活劑大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞質(zhì)密度增加,細胞排列整齊,層次清晰。WB結(jié)果模型組子代鼠海馬組織中自噬相關蛋白Bcl-2的表達量明顯高于正常組,提示造模24h內(nèi)的自噬表達程度較高,可能與宮內(nèi)窘迫模型(缺氧、缺血)激發(fā)自噬相關蛋白Bcl-2大量表達,從而促進自噬的發(fā)生有關。造模后,與模型組相比,針刺組NIX蛋白表達增加(P0.05),提示針刺可以適當促進自噬,從而促進腦細胞的修復。與模型組相比,抑制劑組NIX蛋白表達減少(P0.05),提示3-MA可有效抑制細胞線粒體自噬,在抑制劑的基礎上加入針刺干預NIX蛋白表達較抑制劑組增加(P0.05),提示在外在條件抑制自噬情況下,“靳三針”頭穴針刺干預仍可以有效促進細胞自噬。與模型組相比,激活劑組NIX蛋白表達增加(P0.05),提示雷帕霉素可有效促進細胞線粒體自噬,在激活劑的基礎上加入針刺干預NIX蛋白表達較激活劑組增加(P0.05),提示針刺干預“靳三針”頭穴可以配合激活劑共同促進細胞自噬。造模后,與模型組相比,針刺組Bcl-2蛋白表達量明顯減少(P0.05),提示在給予針刺干預后,線粒體自噬情況有所增加。與模型組相比,抑制劑組Bcl-2蛋白表達顯著增加(P0.05),提示3-MA可有效抑制細胞線粒體自噬,在抑制劑的基礎上加入針刺干預Bcl-2蛋白表達較抑制劑組減少(P0.05),提示在外在條件抑制自噬情況下,“靳三針”頭穴針刺干預仍可以有效促進細胞自噬。與模型組相比,激活劑組Bcl-2蛋白表達增加減少(P0.05),提示雷帕霉素可一定程度促進細胞線粒體自噬,在激活劑的基礎上加入針刺干預Bcl-2蛋白表達較激活劑組減少(P0.05),提示“靳三針”頭穴針刺干預可以配合激活劑共同促進細胞自噬,對因缺血缺氧而損傷的神經(jīng)與腦細胞具有修復的積極作用。結(jié)論:1.針刺可以增強NIX表達及同時促進細胞自噬。2.針刺可影響自噬相關蛋白NIX、Bcl-2的表達,提示針刺促進受損神經(jīng)元的修復可能與NIX、Bcl-2介導的線粒體自噬相關。3.針刺可適度促進受損區(qū)線粒體自噬的表達,同時減少受損區(qū)域神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,提示針刺可能通過促進線粒體自噬的適度表達,從而減少凋亡的發(fā)生。
【圖文】：

相反，激活劑組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞排列致密，神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞邊界清逡逑晰光滑。針刺加激活劑大鼠海馬區(qū)yL經(jīng)元細胞質(zhì)密度增加，細胞排列整齊，層次清晰。逡逑（見圖１）逡逑缺血缺氧腦損傷后，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)破壞嚴重，，表明ＨＩＢＤ可以加重患逡逑兒的神經(jīng)功能缺損，這與臨床表現(xiàn)和研究結(jié)果基本一致。經(jīng)過針刺干｜后，神經(jīng)元結(jié)逡逑構(gòu)和形態(tài)明顯得以改善。自噬被抑制時，與模型組相比，大鼠海馬區(qū)＃經(jīng)細胞損傷更逡逑為嚴重，細胞紊亂空泡化，核固縮、深染，間隙增寬，在此基礎上進行針刺治療，細逡逑胞形態(tài)雖有改善，但仍存在一定程度的神經(jīng)損傷情況。這說明自噬在ＨＩＢＤ的修復過逡逑程中是與時效密切相關的，當缺血缺氧腦損傷后細胞凋亡向細胞次級壞死轉(zhuǎn)化時，再逡逑加以治療恐怕療效不佳，勢必存在不同程度的后遺癥，早期針刺干預對ＨＩＢＤ患兒的逡逑預后療效更好

邐針刺調(diào)控宮內(nèi)窘迫ＨＩＢＤ大鼠ＮＩＸ表達改善缺血缺氧腦損傷的機制邐逡逑表１各組ＨＩＢＤ模型大鼠Ｂｃｌ－２蛋白表達比較ｄ±Ｓ）逡逑組別邐ｎ邐Ｂｃｌ－２邐＾逡逑模型組邐８邐１．０６±０．１９逡逑針刺組邐８邐１．７６±０．１４逡逑激活劑組邐８邐０．８８±０．１６４逡逑抑制劑組邐８邐１．２１±0．２９＃逡逑針刺＋激活劑組邐８邐０．６９±０．１４ａ逡逑針刺＋抑制劑組邐８邐０．８４±０．２６邋＊逡逑注：單因素方差分析，Ｆ＝６．９２，邋Ｐ＜０．０５。與模型組相比，１＜０．０５；與激活劑組相比，逡逑ＡＰ＜０．０５；與抑制劑組相比，＊Ｐ＜０．０５。逡逑ｍｏｄｅｌ邋ｙ＼ｃｕ邋ｐｙ＼ｐＡ邋３－ＭＡ邋Ａｃｕ＋ＲＡＰＡ邋／＼ＣＵ４－３邋ＭＡ邋２0逡逑
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R245;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2668994