【摘要】：新生兒缺氧缺血腦病(hypoxia-ischemic encephalopathy,HIE)是圍產(chǎn)期新生兒缺血缺氧引起的腦損傷疾病,是致使新生兒死亡和導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因之一,存活者多出現(xiàn)智力發(fā)育低下、運(yùn)動發(fā)育遲緩、腦性癱瘓、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)。因此,及時(shí)有效的治療對于HIE患兒及其家庭意義重大。近年來,在治療HIE方面,通過運(yùn)用針刺、艾灸、穴位注射、小兒推拿、中藥口服、熏蒸等中醫(yī)療法成效斐然,特別是針刺療法,在治療HIE后遺癥方面,療效極為顯著。目的:以BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬保護(hù)通路作為切入點(diǎn),建立缺血缺氧腦損傷(Hypoxia-ischemic brain damage,HIBD)大鼠模型,選擇靳三針頭部穴組(腦三針、顳三針、智三針)應(yīng)用針刺干預(yù),同時(shí)加入自噬激活劑雷帕霉素,通過免疫印跡等生物檢測技術(shù)觀察自噬相關(guān)蛋白NIX(Nip3-like protein X/adenovirus 19kDa interacting protein 3-like)、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)的表達(dá)變化,旨在探討針刺對缺氧缺血誘導(dǎo)的受損神經(jīng)元中線粒體自噬水平的影響和作用機(jī)制,有利于為臨床治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxia ischaemic encephalopathy,HIE)提供新的思路和依據(jù)。方法:SPF級SD雌鼠20只,雄鼠10只,按1:1合攏配種,成功配種得孕鼠16只,剖宮產(chǎn)大鼠8只,代乳鼠8只,經(jīng)異氟烷麻醉后剖宮產(chǎn)術(shù),鉗夾雙側(cè)子宮動脈10min,不超過30S,將無菌紗布蓋于雙側(cè)子宮上,鉗夾時(shí)間結(jié)束后,取出新生大鼠,立即、搶救,共得66只仔鼠,其余鼠淘汰。按隨機(jī)數(shù)字表法,每組11只,分為模型組、針刺組、激活劑組、抑制劑組、針刺加激活劑組、針刺加抑制組。在HIBD模型大鼠出生第14天開始干預(yù),每天干預(yù)一次,連續(xù)干預(yù)14天。通過免疫印跡等生物檢測技術(shù)觀察自噬相關(guān)蛋白NIX、Bcl-2的表達(dá)變化,結(jié)果:通過剖腹后鉗夾雙側(cè)子宮動脈制造宮內(nèi)窘迫子代鼠模型,HE染色結(jié)果:模型組大鼠腦部海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列散亂,可見腫脹的神經(jīng)元,結(jié)構(gòu)疏松,神經(jīng)元部分出現(xiàn)核固縮、深染及神經(jīng)元細(xì)胞空泡化。針刺組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞核清晰,核仁明顯。抑制劑組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞更為嚴(yán)重,可見較多變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞,結(jié)構(gòu)疏松,細(xì)胞間隙增寬,核固縮、深染,部分神經(jīng)元胞核消失,空泡化。較抑制劑組,針刺加抑制劑組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)破壞稍有改善,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較前緊密,間隙變窄,但神經(jīng)元仍存在腫脹現(xiàn)象,細(xì)胞邊界欠光滑。相反,激活劑組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列致密,神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞邊界清晰光滑。針刺加激活劑大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)密度增加,細(xì)胞排列整齊,層次清晰。WB結(jié)果模型組子代鼠海馬組織中自噬相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯高于正常組,提示造模24h內(nèi)的自噬表達(dá)程度較高,可能與宮內(nèi)窘迫模型(缺氧、缺血)激發(fā)自噬相關(guān)蛋白Bcl-2大量表達(dá),從而促進(jìn)自噬的發(fā)生有關(guān)。造模后,與模型組相比,針刺組NIX蛋白表達(dá)增加(P0.05),提示針刺可以適當(dāng)促進(jìn)自噬,從而促進(jìn)腦細(xì)胞的修復(fù)。與模型組相比,抑制劑組NIX蛋白表達(dá)減少(P0.05),提示3-MA可有效抑制細(xì)胞線粒體自噬,在抑制劑的基礎(chǔ)上加入針刺干預(yù)NIX蛋白表達(dá)較抑制劑組增加(P0.05),提示在外在條件抑制自噬情況下,“靳三針”頭穴針刺干預(yù)仍可以有效促進(jìn)細(xì)胞自噬。與模型組相比,激活劑組NIX蛋白表達(dá)增加(P0.05),提示雷帕霉素可有效促進(jìn)細(xì)胞線粒體自噬,在激活劑的基礎(chǔ)上加入針刺干預(yù)NIX蛋白表達(dá)較激活劑組增加(P0.05),提示針刺干預(yù)“靳三針”頭穴可以配合激活劑共同促進(jìn)細(xì)胞自噬。造模后,與模型組相比,針刺組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯減少(P0.05),提示在給予針刺干預(yù)后,線粒體自噬情況有所增加。與模型組相比,抑制劑組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P0.05),提示3-MA可有效抑制細(xì)胞線粒體自噬,在抑制劑的基礎(chǔ)上加入針刺干預(yù)Bcl-2蛋白表達(dá)較抑制劑組減少(P0.05),提示在外在條件抑制自噬情況下,“靳三針”頭穴針刺干預(yù)仍可以有效促進(jìn)細(xì)胞自噬。與模型組相比,激活劑組Bcl-2蛋白表達(dá)增加減少(P0.05),提示雷帕霉素可一定程度促進(jìn)細(xì)胞線粒體自噬,在激活劑的基礎(chǔ)上加入針刺干預(yù)Bcl-2蛋白表達(dá)較激活劑組減少(P0.05),提示“靳三針”頭穴針刺干預(yù)可以配合激活劑共同促進(jìn)細(xì)胞自噬,對因缺血缺氧而損傷的神經(jīng)與腦細(xì)胞具有修復(fù)的積極作用。結(jié)論:1.針刺可以增強(qiáng)NIX表達(dá)及同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞自噬。2.針刺可影響自噬相關(guān)蛋白NIX、Bcl-2的表達(dá),提示針刺促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)可能與NIX、Bcl-2介導(dǎo)的線粒體自噬相關(guān)。3.針刺可適度促進(jìn)受損區(qū)線粒體自噬的表達(dá),同時(shí)減少受損區(qū)域神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,提示針刺可能通過促進(jìn)線粒體自噬的適度表達(dá),從而減少凋亡的發(fā)生。
【圖文】：

相反，激活劑組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列致密，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞邊界清逡逑晰光滑。針刺加激活劑大鼠海馬區(qū)yL經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)密度增加，細(xì)胞排列整齊，層次清晰。逡逑（見圖１）逡逑缺血缺氧腦損傷后，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，，表明ＨＩＢＤ可以加重患逡逑兒的神經(jīng)功能缺損，這與臨床表現(xiàn)和研究結(jié)果基本一致。經(jīng)過針刺干｜后，神經(jīng)元結(jié)逡逑構(gòu)和形態(tài)明顯得以改善。自噬被抑制時(shí)，與模型組相比，大鼠海馬區(qū)＃經(jīng)細(xì)胞損傷更逡逑為嚴(yán)重，細(xì)胞紊亂空泡化，核固縮、深染，間隙增寬，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行針刺治療，細(xì)逡逑胞形態(tài)雖有改善，但仍存在一定程度的神經(jīng)損傷情況。這說明自噬在ＨＩＢＤ的修復(fù)過逡逑程中是與時(shí)效密切相關(guān)的，當(dāng)缺血缺氧腦損傷后細(xì)胞凋亡向細(xì)胞次級壞死轉(zhuǎn)化時(shí)，再逡逑加以治療恐怕療效不佳，勢必存在不同程度的后遺癥，早期針刺干預(yù)對ＨＩＢＤ患兒的逡逑預(yù)后療效更好

邐針刺調(diào)控宮內(nèi)窘迫ＨＩＢＤ大鼠ＮＩＸ表達(dá)改善缺血缺氧腦損傷的機(jī)制邐逡逑表１各組ＨＩＢＤ模型大鼠Ｂｃｌ－２蛋白表達(dá)比較ｄ±Ｓ）逡逑組別邐ｎ邐Ｂｃｌ－２邐＾逡逑模型組邐８邐１．０６±０．１９逡逑針刺組邐８邐１．７６±０．１４逡逑激活劑組邐８邐０．８８±０．１６４逡逑抑制劑組邐８邐１．２１±0．２９＃逡逑針刺＋激活劑組邐８邐０．６９±０．１４ａ逡逑針刺＋抑制劑組邐８邐０．８４±０．２６邋＊逡逑注：單因素方差分析，Ｆ＝６．９２，邋Ｐ＜０．０５。與模型組相比，１＜０．０５；與激活劑組相比，逡逑ＡＰ＜０．０５；與抑制劑組相比，＊Ｐ＜０．０５。逡逑ｍｏｄｅｌ邋ｙ＼ｃｕ邋ｐｙ＼ｐＡ邋３－ＭＡ邋Ａｃｕ＋ＲＡＰＡ邋／＼ＣＵ４－３邋ＭＡ邋２0逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R245;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2668994