【摘要】：背景:為了在感染過(guò)程中將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞,包膜病毒利用其表面特殊的蛋白識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體分子以促進(jìn)病毒包膜與靶細(xì)胞膜的融合。副粘病毒(paramyxovirus)屬于有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒,包含多種能感染人和動(dòng)物的重要病原體,例如人副流感病毒(human parainfluenza viruses,hPIVs)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、副流感病毒 5 型(parainfluenza virus type 5,PIV5)等,這些病毒的吸附和膜融合過(guò)程是由病毒包膜表面兩個(gè)不同的蛋白介導(dǎo)的:血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(fusion protein,F)。人副流感病毒 3 型(human parainfluenza virus type3,hPIV3)是引起嬰幼兒發(fā)生氣管炎、支氣管炎和肺炎的重要病原體。hPIV3HN是一種多功能糖蛋白,在病毒的入侵和感染過(guò)程中主要發(fā)揮識(shí)別靶細(xì)胞表面唾液酸受體,促進(jìn)細(xì)胞融合和發(fā)揮神經(jīng)氨酸酶的活性裂解唾液酸受體等功能。HN蛋白是II型病毒包膜糖蛋白,從N端到C端依次為胞質(zhì)尾區(qū)(Cytoplamictail,CT)、跨膜區(qū)(TM)、胞外區(qū)域,其中胞外區(qū)域又由球狀頭部和螺旋狀的頸部組成。有研究表明頸部區(qū)域可形成四卷曲螺旋束狀(four-helixbundle,4HB)結(jié)構(gòu),并且頸部包含能與F蛋白發(fā)生特異性相互作用并激活F蛋白發(fā)生構(gòu)象改變從而啟動(dòng)膜融合的氨基酸位點(diǎn)。近期關(guān)于hPIV3胞外域結(jié)構(gòu)的研究表明,HN蛋白同源四聚化的頭部呈現(xiàn)“頭部下垂”的構(gòu)象,其中兩個(gè)頭部(共價(jià)二聚體)與頸部4HB形成了對(duì)稱的相互作用區(qū)。該區(qū)域包含了激活F蛋白關(guān)鍵的氨基酸殘基位點(diǎn),且下垂的頭部在空間上遮蓋了這些位點(diǎn)導(dǎo)致其無(wú)法與F蛋白發(fā)生相互作用。這種構(gòu)象支持了一種模型,在此模型中,HN頭部識(shí)別受體后會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變,從“頭部下垂”(4-heads down)轉(zhuǎn)化到“頭部抬舉”(4-heads up)狀態(tài)釋放了空間位阻,并促進(jìn)了 HN頸部氨基酸與F蛋白發(fā)生特異性的相互作用。目前關(guān)于HN蛋白頭部結(jié)構(gòu)域的研究較為深入,但缺乏對(duì)其頸部結(jié)構(gòu)域的研究報(bào)道,并且HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)在膜融合過(guò)程中所起的作用尚不清楚。本文將選取hPIV3 HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)15個(gè)氨基酸位點(diǎn)(頭部7個(gè),頸部8個(gè)),分別單點(diǎn)突變?yōu)楸彼?再分別進(jìn)行受體識(shí)別活性、神經(jīng)氨酸酶活性、促細(xì)胞融合活性及蛋白表達(dá)效率等多種功能的檢測(cè)。目的:探討hPIV3 HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)在促進(jìn)細(xì)胞融合過(guò)程中的作用,探討HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)影響膜融合的機(jī)制,試圖定位該區(qū)域在膜融合過(guò)程中起關(guān)鍵作用的氨基酸位點(diǎn)。方法:通過(guò)比對(duì)hPIV3 HN與其高度同源的PIV5、NDV的HN序列,確定hPIV3 HN頭頸部相互作用區(qū)的位置,并采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODLE軟件上以NDVHN(PDB ID:3TIE)為模板得到hPIV3 HN“頭部下垂”構(gòu)象模型,以確定HN頭頸部相互作用區(qū)的位置。1.采用PCR單點(diǎn)突變和菌內(nèi)同源重組技術(shù)突變了該區(qū)域15個(gè)氨基酸位點(diǎn)(頭部7個(gè),頸部8個(gè)),突變成功后通過(guò)T7RNA聚合酶表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)。2.分別采用吉姆薩染色法、指示基因法、R18探針熒光標(biāo)記法定性定量分析各突變體HN蛋白對(duì)膜融合的不同時(shí)期促細(xì)胞融合活性的影響。3.紅細(xì)胞吸附法檢測(cè)各突變體HN蛋白的受體識(shí)別活性。4.神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒法測(cè)定各突變體HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性。5.采用間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)用于定性定量檢測(cè)突變體HN蛋白的表達(dá)效率。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的重復(fù)結(jié)果,采用SPSS軟件中的Student's t檢驗(yàn)分別將各突變體與野生型HN蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較分析,結(jié)果最終以x±SD形式表示,P0.05被認(rèn)為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.應(yīng)用蛋白同源建模軟件將hPIV3 HN蛋白“頭部下垂”構(gòu)象模型構(gòu)建成功,通過(guò)氨基酸比對(duì)確定了 hPIV3 HN頭頸部相互作用區(qū)的位置。并將該區(qū)域15個(gè)氨基酸定點(diǎn)突變,并分別命名為I112A、Q116A、M118A、D120A、R122A、K123A、S126A、E127A、R141A、1142A、D145A、G147A、I148A、L151A、N152A。2.對(duì)15個(gè)突變體蛋白采用三種不同類(lèi)型的膜融合試驗(yàn)(吉姆薩染色法、指示基因法、R18探針熒光標(biāo)記法)檢測(cè)HN在膜融合過(guò)程中對(duì)促細(xì)胞融合活性的影響,三種實(shí)驗(yàn)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本是吻合的。在與F蛋白共同表達(dá)的前提下,I112A、R122A、I148A和L151A這4個(gè)突變體的合胞體形成能力基本喪失,其內(nèi)容物混合能力和半融合活性也大幅度降低;但是R141A、I142A和G147A這三個(gè)突變體與野生型HN相比,合胞體的數(shù)量不但沒(méi)有減少,反而明顯增多且合胞體的面積也有增大的趨勢(shì),同時(shí)內(nèi)容物混合能力和半融合活性都明顯增高。剩下的 8 個(gè)突變體(Q116A、M118A、D120A、K123A、S126A、E127A、D145A、N152A)雖然保留了合胞體的形成能力,然而合胞體形成的數(shù)量和面積都低于野生型,并且內(nèi)容物混合能力和半融合活性也不同程度地降低。3.HN蛋白頭頸相互作用區(qū)15個(gè)突變體蛋白中,只有L151A在細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)效率降到野生型HN蛋白的38.09%,另外14個(gè)突變體蛋白的細(xì)胞表面的表達(dá)效率位于野生型的HN蛋白的86.31%～106.54%之間,與野生型HN相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.受體識(shí)別活性分析結(jié)果表明:E127A、R141A、I142A、D145A、G147A這5個(gè)突變體蛋白的受體識(shí)別活性與野生型HN大體一致(位于野生型HN的88.3%～92.78%之間),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I48A和L151A受體識(shí)別活性降低幅度較大,分別為野生型HN的32.49%和24.61%。其它8個(gè)突變體蛋白受體識(shí)別活性僅為野生型HN蛋白的50%左右。5.各突變體蛋白(除R141A外)的神經(jīng)氨酸酶活性與野生型HN相比都略有降低,R141位點(diǎn)突變?yōu)楸彼岷笫蛊渖窠?jīng)氨酸酶活性增強(qiáng),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:hPIV3HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)對(duì)膜融合功能有重要作用,該區(qū)域氨基酸突變后對(duì)促細(xì)胞融合活性、受體識(shí)別活性和神經(jīng)氨酸酶活性都有不同程度的影響,L151A突變體還直接影響細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,頸部1112、D120和R122氨基酸位點(diǎn)對(duì)膜融合活性的影響可能是由于突變后改變了 HN蛋白與同源F蛋白特異性相互作用而引起的。
【圖文】：

應(yīng)用蛋白同源建模軟件ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ構(gòu)建出ｈＰＩＶ３邋ＨＮ蛋白同源四逡逑聚體“頭部下垂”構(gòu)象的結(jié)構(gòu)模型，至少有兩個(gè)下垂的頭部與頸部接觸形成頭頸逡逑部相互作用區(qū)。圖１將本研究選擇單點(diǎn)突變的１５個(gè)氨基酸（頸部的８?jìng)�(gè)氨基酸，逡逑頭部的７個(gè)氨基酸）的位置在ＨＮ蛋白結(jié)構(gòu)模型中逐一標(biāo)注出來(lái)。采用基因定點(diǎn)逡逑突變和菌內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法將該區(qū)域上１５個(gè)氨基酸分別單點(diǎn)突變?yōu)楸卞义纤幔�，并分別命名為邋ＩＵ２Ａ、Ｑ１１６Ａ、Ｍ１１８Ａ、Ｄ１２０Ａ、Ｒ１２２Ａ、Ｋ１２３Ａ、Ｓ１２６Ａ、逡逑Ｅ１２７Ａ、Ｒ１４１Ａ、Ｉ１４２Ａ、Ｄ１４５Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｉ１４８Ａ、Ｌ１５１Ａ、Ｎ１５２Ａ邋（圖邋１）。逡逑用限制性核酸內(nèi)切酶五ｃｏＲ邋Ｉ和Ｉ分別對(duì)ｈＰＩＶ３邋ｐＢＳＫ－ＨＮ質(zhì)粒進(jìn)行單酶逡逑切后獲得兩個(gè)線性的ＰＣＲ模板。用這兩個(gè)模板配合ｈＰＩＶ３邋ＨＮ頭頸相互作用區(qū)逡逑對(duì)應(yīng)的單點(diǎn)突變ＰＣＲ引物分別進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增后可得到兩個(gè)具有同源末端的ＰＣＲ逡逑產(chǎn)物片段，回收這兩個(gè)具有同源末端的產(chǎn)物片段并利用菌內(nèi)同源重組技術(shù)獲得目逡逑標(biāo)突變體菌落，挑取單菌落，過(guò)夜搖菌增菌后送生物公司測(cè)序，拿到測(cè)序結(jié)果與逡逑原質(zhì)粒進(jìn)行基因比對(duì)分析以驗(yàn)證突變體是否突變成功。逡逑３４逡逑

圖２邋ｈＰＩＶ３邋ＨＮ蛋白頭頸部相互作用區(qū)單點(diǎn)突變時(shí)所用的ＰＣＲ片段電泳圖逡逑ＡｈＰＩＶ３邋ＨＮ蛋白頭頸相互作用區(qū)頸部８?jìng)�(gè)氨基酸單點(diǎn)突變時(shí)所用的ＰＣＲ電泳圖。逡逑Ｂ邋ｈＰＩＶ３邋ＨＮ蛋白頭頸相互作用區(qū)頭部７個(gè)氨基酸單點(diǎn)突變時(shí)所用的ＰＣＲ電泳圖。逡逑Ｆｉｇ邋２．邋Ｔｈｅ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｎｔｓ邋ａｔ邋ｓｔａｌｋ／ｈｅａｄ邋ｉｎｔｅｒｆａｃｈＰＩＶ３邋ＨＮ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑Ａ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｎｔｓ邋ａｔ邋ｓｔａｌｋ邋ｒｅｇｉｏｎ．逡逑Ｍ：邋ＤＬ５０００邋ＤＭＡ邋Ｍａｒｋｅｒ．邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｍｕｔａｔｉｏｎ邋ａｔ邋ｓｔａｌｋ邋ｒｅｇｉｏｎ．邋１，邋Ｉ１１２Ａ－Ｐ１，２３２Ｉ１１２Ａ－Ｐ２，邋２５５５；邋３，邋Ｑ１１６Ａ－Ｐ１，邋２３１４；邋４，邋Ｑ１１６Ａ－Ｐ２１，邋２５６４；邋５，邋Ｍ１１８Ａ－Ｐ１，邋２３０６；邋６，邋Ｍ１１８Ａ２５７２；邋７，邋Ｄ１２０Ａ－Ｐ１，邋２３０２；邋８，邋Ｄ１２０Ａ－Ｐ２，邋２５７６；邋９，邋Ｒ１２２Ａ－Ｐ１，邋２２９５；邋１０，邋Ｒ１２２Ａ－Ｐ２，邋２５８３；Ｋ１２３Ａ－Ｐ１，邋２２９３；邋１２，邋Ｋ１２３Ａ－Ｐ２，邋２５８５；邋１３，邋Ｓ１２６Ａ－Ｐ１，邋２２８４；邋１４，邋Ｓ１２６Ａ－Ｐ２，邋２５９４；邋１５，邋Ｅ１２７Ａ２２７９；１６，邋Ｅ１２７Ａ－Ｐ２，邋２５９９．逡逑Ｂ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｎｔｓ邋ａｔ邋ｈｅａｄ邋ｒｅｇｉｏｎ．邋Ｍ：邋ＤＬ５０００
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R373.13

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本文編號(hào)：2667413