【摘要】：背景:為了在感染過程中將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至靶細胞,包膜病毒利用其表面特殊的蛋白識別宿主細胞表面的受體分子以促進病毒包膜與靶細胞膜的融合。副粘病毒(paramyxovirus)屬于有包膜的單股負鏈RNA病毒,包含多種能感染人和動物的重要病原體,例如人副流感病毒(human parainfluenza viruses,hPIVs)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、副流感病毒 5 型(parainfluenza virus type 5,PIV5)等,這些病毒的吸附和膜融合過程是由病毒包膜表面兩個不同的蛋白介導的:血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(fusion protein,F)。人副流感病毒 3 型(human parainfluenza virus type3,hPIV3)是引起嬰幼兒發(fā)生氣管炎、支氣管炎和肺炎的重要病原體。hPIV3HN是一種多功能糖蛋白,在病毒的入侵和感染過程中主要發(fā)揮識別靶細胞表面唾液酸受體,促進細胞融合和發(fā)揮神經(jīng)氨酸酶的活性裂解唾液酸受體等功能。HN蛋白是II型病毒包膜糖蛋白,從N端到C端依次為胞質(zhì)尾區(qū)(Cytoplamictail,CT)、跨膜區(qū)(TM)、胞外區(qū)域,其中胞外區(qū)域又由球狀頭部和螺旋狀的頸部組成。有研究表明頸部區(qū)域可形成四卷曲螺旋束狀(four-helixbundle,4HB)結(jié)構(gòu),并且頸部包含能與F蛋白發(fā)生特異性相互作用并激活F蛋白發(fā)生構(gòu)象改變從而啟動膜融合的氨基酸位點。近期關(guān)于hPIV3胞外域結(jié)構(gòu)的研究表明,HN蛋白同源四聚化的頭部呈現(xiàn)“頭部下垂”的構(gòu)象,其中兩個頭部(共價二聚體)與頸部4HB形成了對稱的相互作用區(qū)。該區(qū)域包含了激活F蛋白關(guān)鍵的氨基酸殘基位點,且下垂的頭部在空間上遮蓋了這些位點導致其無法與F蛋白發(fā)生相互作用。這種構(gòu)象支持了一種模型,在此模型中,HN頭部識別受體后會發(fā)生構(gòu)象改變,從“頭部下垂”(4-heads down)轉(zhuǎn)化到“頭部抬舉”(4-heads up)狀態(tài)釋放了空間位阻,并促進了 HN頸部氨基酸與F蛋白發(fā)生特異性的相互作用。目前關(guān)于HN蛋白頭部結(jié)構(gòu)域的研究較為深入,但缺乏對其頸部結(jié)構(gòu)域的研究報道,并且HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)在膜融合過程中所起的作用尚不清楚。本文將選取hPIV3 HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)15個氨基酸位點(頭部7個,頸部8個),分別單點突變?yōu)楸彼?再分別進行受體識別活性、神經(jīng)氨酸酶活性、促細胞融合活性及蛋白表達效率等多種功能的檢測。目的:探討hPIV3 HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)在促進細胞融合過程中的作用,探討HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)影響膜融合的機制,試圖定位該區(qū)域在膜融合過程中起關(guān)鍵作用的氨基酸位點。方法:通過比對hPIV3 HN與其高度同源的PIV5、NDV的HN序列,確定hPIV3 HN頭頸部相互作用區(qū)的位置,并采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODLE軟件上以NDVHN(PDB ID:3TIE)為模板得到hPIV3 HN“頭部下垂”構(gòu)象模型,以確定HN頭頸部相互作用區(qū)的位置。1.采用PCR單點突變和菌內(nèi)同源重組技術(shù)突變了該區(qū)域15個氨基酸位點(頭部7個,頸部8個),突變成功后通過T7RNA聚合酶表達系統(tǒng)進行蛋白表達。2.分別采用吉姆薩染色法、指示基因法、R18探針熒光標記法定性定量分析各突變體HN蛋白對膜融合的不同時期促細胞融合活性的影響。3.紅細胞吸附法檢測各突變體HN蛋白的受體識別活性。4.神經(jīng)氨酸酶檢測試劑盒法測定各突變體HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性。5.采用間接免疫熒光和流式細胞術(shù)實驗用于定性定量檢測突變體HN蛋白的表達效率。6.統(tǒng)計學方法:實驗數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的重復結(jié)果,采用SPSS軟件中的Student's t檢驗分別將各突變體與野生型HN蛋白的實驗數(shù)據(jù)進行兩兩比較分析,結(jié)果最終以x±SD形式表示,P0.05被認為差別有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.應用蛋白同源建模軟件將hPIV3 HN蛋白“頭部下垂”構(gòu)象模型構(gòu)建成功,通過氨基酸比對確定了 hPIV3 HN頭頸部相互作用區(qū)的位置。并將該區(qū)域15個氨基酸定點突變,并分別命名為I112A、Q116A、M118A、D120A、R122A、K123A、S126A、E127A、R141A、1142A、D145A、G147A、I148A、L151A、N152A。2.對15個突變體蛋白采用三種不同類型的膜融合試驗(吉姆薩染色法、指示基因法、R18探針熒光標記法)檢測HN在膜融合過程中對促細胞融合活性的影響,三種實驗得出的實驗結(jié)果基本是吻合的。在與F蛋白共同表達的前提下,I112A、R122A、I148A和L151A這4個突變體的合胞體形成能力基本喪失,其內(nèi)容物混合能力和半融合活性也大幅度降低;但是R141A、I142A和G147A這三個突變體與野生型HN相比,合胞體的數(shù)量不但沒有減少,反而明顯增多且合胞體的面積也有增大的趨勢,同時內(nèi)容物混合能力和半融合活性都明顯增高。剩下的 8 個突變體(Q116A、M118A、D120A、K123A、S126A、E127A、D145A、N152A)雖然保留了合胞體的形成能力,然而合胞體形成的數(shù)量和面積都低于野生型,并且內(nèi)容物混合能力和半融合活性也不同程度地降低。3.HN蛋白頭頸相互作用區(qū)15個突變體蛋白中,只有L151A在細胞表面的蛋白表達效率降到野生型HN蛋白的38.09%,另外14個突變體蛋白的細胞表面的表達效率位于野生型的HN蛋白的86.31%～106.54%之間,與野生型HN相比差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.受體識別活性分析結(jié)果表明:E127A、R141A、I142A、D145A、G147A這5個突變體蛋白的受體識別活性與野生型HN大體一致(位于野生型HN的88.3%～92.78%之間),經(jīng)統(tǒng)計學分析差別無統(tǒng)計學意義。I48A和L151A受體識別活性降低幅度較大,分別為野生型HN的32.49%和24.61%。其它8個突變體蛋白受體識別活性僅為野生型HN蛋白的50%左右。5.各突變體蛋白(除R141A外)的神經(jīng)氨酸酶活性與野生型HN相比都略有降低,R141位點突變?yōu)楸彼岷笫蛊渖窠?jīng)氨酸酶活性增強,經(jīng)統(tǒng)計學分析后差異均有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:hPIV3HN蛋白頭頸部相互作用區(qū)對膜融合功能有重要作用,該區(qū)域氨基酸突變后對促細胞融合活性、受體識別活性和神經(jīng)氨酸酶活性都有不同程度的影響,L151A突變體還直接影響細胞表面蛋白質(zhì)的表達水平,頸部1112、D120和R122氨基酸位點對膜融合活性的影響可能是由于突變后改變了 HN蛋白與同源F蛋白特異性相互作用而引起的。
【圖文】：

應用蛋白同源建模軟件ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ構(gòu)建出ｈＰＩＶ３邋ＨＮ蛋白同源四逡逑聚體“頭部下垂”構(gòu)象的結(jié)構(gòu)模型，至少有兩個下垂的頭部與頸部接觸形成頭頸逡逑部相互作用區(qū)。圖１將本研究選擇單點突變的１５個氨基酸（頸部的８個氨基酸，逡逑頭部的７個氨基酸）的位置在ＨＮ蛋白結(jié)構(gòu)模型中逐一標注出來。采用基因定點逡逑突變和菌內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法將該區(qū)域上１５個氨基酸分別單點突變?yōu)楸卞义纤�，，并分別命名為邋ＩＵ２Ａ、Ｑ１１６Ａ、Ｍ１１８Ａ、Ｄ１２０Ａ、Ｒ１２２Ａ、Ｋ１２３Ａ、Ｓ１２６Ａ、逡逑Ｅ１２７Ａ、Ｒ１４１Ａ、Ｉ１４２Ａ、Ｄ１４５Ａ、Ｇ１４７Ａ、Ｉ１４８Ａ、Ｌ１５１Ａ、Ｎ１５２Ａ邋（圖邋１）。逡逑用限制性核酸內(nèi)切酶五ｃｏＲ邋Ｉ和Ｉ分別對ｈＰＩＶ３邋ｐＢＳＫ－ＨＮ質(zhì)粒進行單酶逡逑切后獲得兩個線性的ＰＣＲ模板。用這兩個模板配合ｈＰＩＶ３邋ＨＮ頭頸相互作用區(qū)逡逑對應的單點突變ＰＣＲ引物分別進行ＰＣＲ擴增后可得到兩個具有同源末端的ＰＣＲ逡逑產(chǎn)物片段，回收這兩個具有同源末端的產(chǎn)物片段并利用菌內(nèi)同源重組技術(shù)獲得目逡逑標突變體菌落，挑取單菌落，過夜搖菌增菌后送生物公司測序，拿到測序結(jié)果與逡逑原質(zhì)粒進行基因比對分析以驗證突變體是否突變成功。逡逑３４逡逑

圖２邋ｈＰＩＶ３邋ＨＮ蛋白頭頸部相互作用區(qū)單點突變時所用的ＰＣＲ片段電泳圖逡逑ＡｈＰＩＶ３邋ＨＮ蛋白頭頸相互作用區(qū)頸部８個氨基酸單點突變時所用的ＰＣＲ電泳圖。逡逑Ｂ邋ｈＰＩＶ３邋ＨＮ蛋白頭頸相互作用區(qū)頭部７個氨基酸單點突變時所用的ＰＣＲ電泳圖。逡逑Ｆｉｇ邋２．邋Ｔｈｅ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｎｔｓ邋ａｔ邋ｓｔａｌｋ／ｈｅａｄ邋ｉｎｔｅｒｆａｃｈＰＩＶ３邋ＨＮ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑Ａ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｎｔｓ邋ａｔ邋ｓｔａｌｋ邋ｒｅｇｉｏｎ．逡逑Ｍ：邋ＤＬ５０００邋ＤＭＡ邋Ｍａｒｋｅｒ．邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｍｕｔａｔｉｏｎ邋ａｔ邋ｓｔａｌｋ邋ｒｅｇｉｏｎ．邋１，邋Ｉ１１２Ａ－Ｐ１，２３２Ｉ１１２Ａ－Ｐ２，邋２５５５；邋３，邋Ｑ１１６Ａ－Ｐ１，邋２３１４；邋４，邋Ｑ１１６Ａ－Ｐ２１，邋２５６４；邋５，邋Ｍ１１８Ａ－Ｐ１，邋２３０６；邋６，邋Ｍ１１８Ａ２５７２；邋７，邋Ｄ１２０Ａ－Ｐ１，邋２３０２；邋８，邋Ｄ１２０Ａ－Ｐ２，邋２５７６；邋９，邋Ｒ１２２Ａ－Ｐ１，邋２２９５；邋１０，邋Ｒ１２２Ａ－Ｐ２，邋２５８３；Ｋ１２３Ａ－Ｐ１，邋２２９３；邋１２，邋Ｋ１２３Ａ－Ｐ２，邋２５８５；邋１３，邋Ｓ１２６Ａ－Ｐ１，邋２２８４；邋１４，邋Ｓ１２６Ａ－Ｐ２，邋２５９４；邋１５，邋Ｅ１２７Ａ２２７９；１６，邋Ｅ１２７Ａ－Ｐ２，邋２５９９．逡逑Ｂ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｎｔｓ邋ａｔ邋ｈｅａｄ邋ｒｅｇｉｏｎ．邋Ｍ：邋ＤＬ５０００
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373.13

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本文編號：2667413