【摘要】：背景:嚴(yán)重的角膜緣干細(xì)胞缺乏會導(dǎo)致失明,而干細(xì)胞治療為此類患者帶來了復(fù)明的希望。目前自體角膜緣組織和角膜緣干細(xì)胞移植已經(jīng)在臨床上取得了顯著的效果。但當(dāng)雙眼的角膜緣干細(xì)胞嚴(yán)重缺乏不足以分離培養(yǎng)時則需要尋找合適的干細(xì)胞來源,而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于其眾多優(yōu)點被廣泛用于實驗研究中。已有研究報道在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功地誘導(dǎo)為角膜樣上皮細(xì)胞,但是對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后在體內(nèi)分化方向的研究尚少。目的:本實驗主要觀察未經(jīng)誘導(dǎo)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植到兔角膜緣干細(xì)胞完全缺乏模型后在眼表面的分化情況。方法:3-5月齡清潔級日本大耳白兔24只,采用角膜緣環(huán)形板層切除術(shù)加中央角膜上皮刮除術(shù)建立兔右眼角膜緣干細(xì)胞完全缺乏模型,4周后觀察眼表形態(tài),行蘇木素-伊紅(HE)染色、過碘酸-雪夫(PAS)染色及DAPI染色鑒定模型成功與否,選取成功模型中的18只(36只眼),應(yīng)用隨機數(shù)字表法分為三組包括模型組,單純羊膜移植組,BMSCs聯(lián)合羊膜移植組,其中每組6只(兔右眼),而正常對照組為18只成功模型兔的左眼。取第三代(P3)兔BMSCs,以去上皮羊膜為載體培養(yǎng)觀察,待細(xì)胞鋪滿羊膜達(dá)90%以上時進(jìn)行移植手術(shù),于移植術(shù)后12周觀察兔右眼表形態(tài),行HE染色觀察角膜結(jié)構(gòu),免疫熒光檢測角膜上皮細(xì)胞(CECs)分化標(biāo)記物CK3+12的表達(dá)。結(jié)果:建模后4周有21只兔右眼眼表形態(tài)評分達(dá)到7分及7分以上,取3只行HE染色、PAS染色、DAPI染色,模型組HE結(jié)果顯示角膜緣及角膜上皮細(xì)胞層被清除,淺基質(zhì)層有大量炎癥細(xì)胞浸潤及新生血管形成,PAS染色可見杯狀細(xì)胞形成及新生血管形成,DAPI染色顯示上皮層未見細(xì)胞核,淺基質(zhì)層細(xì)胞核明顯增多,說明模型構(gòu)建成功。移植術(shù)后12周照相觀察眼表形態(tài),與自身兔左眼角膜相比,模型組兔右眼角膜混濁,有大量新生血管,羊膜組右眼角膜輕度混濁,有少量新生血管,羊膜加BMSCs組兔右眼角膜透明,未見新生血管;HE染色顯示羊膜加BMSCs組角膜結(jié)構(gòu)修復(fù)完整,免疫熒光檢測到羊膜加BMSCs組有角膜分化的特異性標(biāo)記因子CK3+12表達(dá),而羊膜組未見表達(dá)。結(jié)論:兔BMSCs移植到兔角膜緣干細(xì)胞完全缺乏模型后,在體內(nèi)能夠分化成兔CECs或角膜樣上皮細(xì)胞,恢復(fù)眼表結(jié)構(gòu)及功能。
【圖文】：

石蠟包埋，切片，烤片，切片再繼續(xù)脫蠟水化，分組后制作好的切片再進(jìn)行染色。2.2 結(jié)果2.2.1 建模步驟及術(shù)后眼表形態(tài)觀察建立兔角膜緣干細(xì)胞缺乏模型的步驟：角膜緣環(huán)形板層切除（圖 2.2.1A），中央角膜上皮刮除（圖 2.2.1B），術(shù)后角膜緣環(huán)完整去除，角膜上皮層完整刮除，角膜輕度水腫，仍透明（圖 2.2.1C）。術(shù)后 3 天與 4 周眼表形態(tài)與術(shù)前相比較：術(shù)前角膜透明無水腫，虹膜紋理清晰，瞳孔清晰，無新生血管（圖 2.2.1D），建模后 3 天角膜呈中度水腫混濁，虹膜紋理及瞳孔不清晰，有細(xì)小新生血管形成（圖 2.2.1E），建模后 4 周與正常兔眼相比，角膜輕度水腫，重度混濁，虹膜紋理及瞳孔不可見，明顯有新生血管長入角膜（圖 2.2.1F）。觀察到第 4 周模型各項指標(biāo)基本穩(wěn)定。

2.2 建模后各時間點眼表形態(tài)評分分別于建模術(shù)后當(dāng)天、術(shù)后 1 周、2 周、3 周、4 周對模型眼角膜混濁程度，皮熒光色素染色及新生血管形成情況進(jìn)行評分（參照綜述中的表 1），通過統(tǒng)計析及作圖發(fā)現(xiàn)，角膜渾濁度第 1 周變化最顯著，第 2-4 周基本穩(wěn)定，混濁度評分 2 分以上；建模術(shù)后立即行上皮熒光色素染色觀察到全部角膜黃染，后每周著面積較前縮小，第 3-4 周趨于穩(wěn)定，各象限均有點片狀著色，著色評分在 2 分以；角膜新生血管數(shù)量每周遞增，第 4 周后未見明顯增多，評分可達(dá) 3 分以上。見，在第 4 周時，各單項評分達(dá)標(biāo)，眼表綜合形態(tài)評分也已達(dá) 7 分以上，由此出，，第 4 周模型的眼表形態(tài)基本穩(wěn)定（圖 2.2.2）。
【學(xué)位授予單位】：湖北醫(yī)藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R-332;R772.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2666833