【摘要】：目的:制備特異性抗人表皮生長因子受體(EGFR)的單鏈抗體(scFv),并鑒定其生物學(xué)功能。構(gòu)建靶向人EGFR的慢病毒載體,通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備病毒液,測定病毒滴度,感染293FT細(xì)胞鑒定表達(dá)。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶(Fluc)和紅色熒光蛋白(RFP)的人肺癌細(xì)胞系,為建立活體成像的人肺癌裸鼠移植瘤模型建立及進(jìn)一步研究基于EGFR單鏈抗體的免疫治療奠定基礎(chǔ)。方法:從分泌抗人EGFR單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系提取總RNA,利用5’RACE技術(shù)擴(kuò)增輕鏈和重鏈可變區(qū)(V_L、V_H)基因,構(gòu)建具有V_L、V_H基因的單鏈抗體基因,并將構(gòu)建的單鏈抗體基因克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中進(jìn)行表達(dá)和鑒定。ELISA鑒定單鏈抗體對抗原的特異性;Fortebio檢測抗原抗體間的親和力,流式細(xì)胞術(shù)檢測單鏈抗體結(jié)合肺癌細(xì)胞系天然EGFR的功能活性。設(shè)計(jì)以EGFR-scFv靶向EGFR的CAR結(jié)構(gòu),將此目的基因連接到慢病毒載體并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集病毒液后,利用qRT-PCR法檢測病毒的滴度。構(gòu)建熒光素酶和紅色熒光蛋白的慢病毒載體pHBLV-Fluc-RFP,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,完整病毒感染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975和人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系K562,用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株,分別用熒光顯微鏡、定量PCR檢測確證紅色熒光蛋白和熒光素酶表達(dá)。結(jié)果:獲得唯一的輕重鏈可變區(qū)序列V_L、V_H,成功構(gòu)建EGFR-scFv,特異性與天然EGFR蛋白結(jié)合,親和力達(dá)3.22×10~(-9)mol/L。構(gòu)建含有EGFR-scFv的慢病毒載體,將構(gòu)建好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集的病毒濃縮液經(jīng)稀釋后感染293T細(xì)胞,采用qRT-PCR方法成功完成病毒滴度的測定,且用慢病毒感染293T細(xì)胞顯示病毒可以正常表達(dá)。成功構(gòu)建pHBLV-Fluc-RFP慢病毒載體,獲得了穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶和紅色熒光蛋白的A549、H1975和K562細(xì)胞。結(jié)論:成功構(gòu)建了抗人EGFR單鏈抗體,并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了EGFR-scFv-CD28-CD137-CD3結(jié)構(gòu)慢病毒表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝成慢病毒顆粒,獲得了該基因的病毒液,并測定了病毒液滴度,通過感染細(xì)胞后用流式細(xì)胞術(shù)鑒定了外源修飾目的基因的表達(dá),為肺癌免疫導(dǎo)向治療研究奠定了基礎(chǔ)。獲得的紅色熒光蛋白和熒光素酶雙表達(dá)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975和人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系K562,為人肺癌細(xì)胞免疫缺陷小鼠模型活體成像提供新熒光配色細(xì)胞模型。
【圖文】：

ELISA檢測抗人EGFR單克隆

SDS-PAGE Western blot圖 3 單鏈抗體表達(dá)的 SDS-PAGE 和 Western 鑒定M：蛋白 Mark；1-3：轉(zhuǎn)染后第 2、第 4 和第 6 天收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清在還原條件條帶；N1：還原條件下的陰性對照；4-6：轉(zhuǎn)染后在第 2、第 4 和第 6 天收集的上清在非還原條件下的條帶；N2：非還原條件下陰性對照；P：陽性對照：multi
【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2667579