【摘要】：目的:構建鼠衣原體(Chlamydia muridarum,Cm)TC0668蛋白的原核表達質粒pGEX4T-tc0668,誘導GST-TC0668重組蛋白在大腸桿菌表達并純化,制備目的蛋白鼠源性多克隆抗體和兔源性多克隆抗體,測定TC0668在HeLa細胞中的定位、時相表達及誘導細胞因子的表達情況,為了解TC0668在鼠衣原體致病過程中的作用機制,進而研究其在沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)中的同源蛋白CT389奠定了基礎。方法:1.利用軟件比對TC0668蛋白和Ct毒力因子CT389蛋白的相似性。利用Sopma軟件分析它的二級結構。采用在線軟件Swiss-model搜索與TC0668蛋白結構最為接近的蛋白質,然后利用該蛋白為模板模擬TC0668蛋白的三級結構。2.根據(jù)tc0668基因序列設計特異性PCR引物,以Cm野生型基因組為模板進行PCR擴增tc0668基因�；厥漳康钠闻c雙酶切的pGEX4T-1相連,構建表達重組質粒p GEX4T-tc0668,轉化大腸埃希菌(E.coli BL21),使用IPTG誘導GST-TC0668重組蛋白的表達,用GST-瓊脂糖樹脂純化GST-TC0668重組蛋白,然后去內(nèi)毒素。3.將GST-TC0668重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠和新西蘭兔并收集抗血清,測定抗血清與GST-TC0668重組蛋白的反應及效價,純化獲得的目的蛋白鼠源性多克隆抗體和兔源性多克隆抗體。4.預備單層HeLa細胞,以實驗室保存的Cm NiggⅡ菌株感染單層HeLa細胞0、4、8、12、16、20和24h,收集感染后各個時間點感染標本的總RNA,利用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RTq-PCR)檢測tc0668的mRNA水平,WB和間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測4、8、12、16、20和24h感染標本的TC0668蛋白表達情況。5.預備單層HeLa細胞,用Cm NiggⅡ菌株感染單層HeLa細胞24h,以IncA、HSP60等蛋白為對照,利用IFA檢測感染24h后感染細胞中TC0668的定位情況。并通過感染周期不同時間點的IFA進一步確證。6.預備單層HeLa細胞,分別用等量的Cm tc0668單基因突變菌株(Cm tc0668~(mut))和對應的Cm tc0668單基因野生型菌株(Cm tc0668~(wt))感染單層細胞,24h后收集上清和細胞裂解液,用蛋白芯片檢測細胞上清液和裂解液中的細胞因子水平。結果:1.生物信息學結果顯示,tc0668和ct389基因及其編碼產(chǎn)物的相似性高達84%和92%,TC0668蛋白α-螺旋、無規(guī)卷曲和β片層的含量分別為17.4%、60.78%和21.81%。2.PCR擴增獲得大小約1227 bp的目的片段,與tc0668基因預期大小相符合。將其連接到表達載體p GEX4T-1,獲得重組質粒pGEX4T-tc0668。重組質粒轉化大腸埃希菌E.coli BL21,IPTG誘導表達分子質量約為72 kDa的GST-TC0668重組蛋白,與預期值相符。經(jīng)GST瓊脂糖樹脂柱層析純化,得到GST-TC0668重組蛋白。3.GST-TC0668重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠和新西蘭兔,收獲的免疫血清經(jīng)純化分別獲得鼠源性和兔源性的多克隆抗體,經(jīng)檢測多克隆抗體均能識別GST-TC0668重組蛋白,且效價≥1:64000。4.IFA對Cm Nigg II菌株感染HeLa細胞24h后表達的內(nèi)源性蛋白進行定位,TC0668抗體標記與IncA抗體標記相似,而與Pgp3和HSP60不同的信號。5.RTq-PCR結果顯示,Cm感染HeLa細胞4h后,tc0668基因開始轉錄,16h表達量明顯升高,之后維持高轉錄水平,WB和IFA結果顯示,TC0668蛋白于4h開始產(chǎn)生,于16h左右顯著增多,且持續(xù)到感染周期結束。6.Cm tc0668~(mut)和Cm tc0668~(wt)菌株感染HeLa細胞24h后收集上清和細胞裂解液,用蛋白芯片檢測細胞因子表達情況。與Cm tc0668~(wt)菌株相比,tc0668~(mut)菌株的感染細胞上清中有73個細胞因子表達下調,其中有統(tǒng)計學差異的有36個(P0.05);33個細胞因子表達上調,其中有統(tǒng)計學差異的有10個(P0.05)。收集的細胞裂解液中,相比于Cm tc0668~(wt)菌株,tc0668~(mut)菌株的感染細胞裂解液中表達上調和下調的細胞因子部分與上清一致,另一部分則剛好相反。結論:1.TC0668蛋白可能為衣原體的一種早期分泌的包涵體膜蛋白。2.TC0668蛋白可能通過調控細胞因子的表達影響生殖道病變。
【圖文】：

TC0668 氨基酸序列分析和蛋白結構預測將兩基因編碼蛋白質的氨基酸序列進行相似性分析，發(fā)現(xiàn) TC0068 蛋白10 個氨基酸，與 CT389 相同的氨基酸數(shù)目為 389 個，與 CT389 不同的個氨基酸，氨基酸序列的相似性高達 92%（圖 2）。通過分析，Cm TCt CT389 蛋白具有高度的同源性。

圖 1.3 TC0668 蛋白的二級結構示意圖Fig 1.3 Secondary Structure of TC0668 ProteinPrediction of secondary structure of TC0668 protein using Sopma software, blue for alpha helix,red for extended strand and purple for random coil.4.3 pGEX4T-1/tc0668 原核表達載體構建及鑒定4.3.1 tc0668 基因 PCR 擴增結果對 Cm 基因組中的 tc0668 基因進行 PCR 擴增，取 4μL 擴增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖所示，在大小約為 1227bp 位置可見清晰的特異性條帶，，與 tc0668 的預期片段大小相符。1500bpM 1 2
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R374

【參考文獻】

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1 陳玉玉;吳移謀;劉良專;陳麗麗;張秋桂;;肺炎嗜衣原體Cpn0810重組蛋白誘導THP-1細胞產(chǎn)生促炎因子和凋亡的研究[J];細胞與分子免疫學雜志;2011年09期

2 賈天軍;劉殿武;羅建華;張庶民;鐘光明;;肺炎衣原體CPn0308的基因克隆及其內(nèi)源性蛋白定位的研究[J];衛(wèi)生研究;2008年02期

本文編號：2666560