【摘要】：目的:構(gòu)建鼠衣原體(Chlamydia muridarum,Cm)TC0668蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-tc0668,誘導(dǎo)GST-TC0668重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)并純化,制備目的蛋白鼠源性多克隆抗體和兔源性多克隆抗體,測定TC0668在HeLa細(xì)胞中的定位、時相表達(dá)及誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)情況,為了解TC0668在鼠衣原體致病過程中的作用機(jī)制,進(jìn)而研究其在沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)中的同源蛋白CT389奠定了基礎(chǔ)。方法:1.利用軟件比對TC0668蛋白和Ct毒力因子CT389蛋白的相似性。利用Sopma軟件分析它的二級結(jié)構(gòu)。采用在線軟件Swiss-model搜索與TC0668蛋白結(jié)構(gòu)最為接近的蛋白質(zhì),然后利用該蛋白為模板模擬TC0668蛋白的三級結(jié)構(gòu)。2.根據(jù)tc0668基因序列設(shè)計特異性PCR引物,以Cm野生型基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增tc0668基因�；厥漳康钠闻c雙酶切的pGEX4T-1相連,構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒p GEX4T-tc0668,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(E.coli BL21),使用IPTG誘導(dǎo)GST-TC0668重組蛋白的表達(dá),用GST-瓊脂糖樹脂純化GST-TC0668重組蛋白,然后去內(nèi)毒素。3.將GST-TC0668重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠和新西蘭兔并收集抗血清,測定抗血清與GST-TC0668重組蛋白的反應(yīng)及效價,純化獲得的目的蛋白鼠源性多克隆抗體和兔源性多克隆抗體。4.預(yù)備單層HeLa細(xì)胞,以實驗室保存的Cm NiggⅡ菌株感染單層HeLa細(xì)胞0、4、8、12、16、20和24h,收集感染后各個時間點感染標(biāo)本的總RNA,利用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RTq-PCR)檢測tc0668的mRNA水平,WB和間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測4、8、12、16、20和24h感染標(biāo)本的TC0668蛋白表達(dá)情況。5.預(yù)備單層HeLa細(xì)胞,用Cm NiggⅡ菌株感染單層HeLa細(xì)胞24h,以IncA、HSP60等蛋白為對照,利用IFA檢測感染24h后感染細(xì)胞中TC0668的定位情況。并通過感染周期不同時間點的IFA進(jìn)一步確證。6.預(yù)備單層HeLa細(xì)胞,分別用等量的Cm tc0668單基因突變菌株(Cm tc0668~(mut))和對應(yīng)的Cm tc0668單基因野生型菌株(Cm tc0668~(wt))感染單層細(xì)胞,24h后收集上清和細(xì)胞裂解液,用蛋白芯片檢測細(xì)胞上清液和裂解液中的細(xì)胞因子水平。結(jié)果:1.生物信息學(xué)結(jié)果顯示,tc0668和ct389基因及其編碼產(chǎn)物的相似性高達(dá)84%和92%,TC0668蛋白α-螺旋、無規(guī)卷曲和β片層的含量分別為17.4%、60.78%和21.81%。2.PCR擴(kuò)增獲得大小約1227 bp的目的片段,與tc0668基因預(yù)期大小相符合。將其連接到表達(dá)載體p GEX4T-1,獲得重組質(zhì)粒pGEX4T-tc0668。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coli BL21,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)分子質(zhì)量約為72 kDa的GST-TC0668重組蛋白,與預(yù)期值相符。經(jīng)GST瓊脂糖樹脂柱層析純化,得到GST-TC0668重組蛋白。3.GST-TC0668重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠和新西蘭兔,收獲的免疫血清經(jīng)純化分別獲得鼠源性和兔源性的多克隆抗體,經(jīng)檢測多克隆抗體均能識別GST-TC0668重組蛋白,且效價≥1:64000。4.IFA對Cm Nigg II菌株感染HeLa細(xì)胞24h后表達(dá)的內(nèi)源性蛋白進(jìn)行定位,TC0668抗體標(biāo)記與IncA抗體標(biāo)記相似,而與Pgp3和HSP60不同的信號。5.RTq-PCR結(jié)果顯示,Cm感染HeLa細(xì)胞4h后,tc0668基因開始轉(zhuǎn)錄,16h表達(dá)量明顯升高,之后維持高轉(zhuǎn)錄水平,WB和IFA結(jié)果顯示,TC0668蛋白于4h開始產(chǎn)生,于16h左右顯著增多,且持續(xù)到感染周期結(jié)束。6.Cm tc0668~(mut)和Cm tc0668~(wt)菌株感染HeLa細(xì)胞24h后收集上清和細(xì)胞裂解液,用蛋白芯片檢測細(xì)胞因子表達(dá)情況。與Cm tc0668~(wt)菌株相比,tc0668~(mut)菌株的感染細(xì)胞上清中有73個細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào),其中有統(tǒng)計學(xué)差異的有36個(P0.05);33個細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào),其中有統(tǒng)計學(xué)差異的有10個(P0.05)。收集的細(xì)胞裂解液中,相比于Cm tc0668~(wt)菌株,tc0668~(mut)菌株的感染細(xì)胞裂解液中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的細(xì)胞因子部分與上清一致,另一部分則剛好相反。結(jié)論:1.TC0668蛋白可能為衣原體的一種早期分泌的包涵體膜蛋白。2.TC0668蛋白可能通過調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)影響生殖道病變。
【圖文】：

TC0668 氨基酸序列分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測將兩基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn) TC0068 蛋白10 個氨基酸，與 CT389 相同的氨基酸數(shù)目為 389 個，與 CT389 不同的個氨基酸，氨基酸序列的相似性高達(dá) 92%（圖 2）。通過分析，Cm TCt CT389 蛋白具有高度的同源性。

圖 1.3 TC0668 蛋白的二級結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1.3 Secondary Structure of TC0668 ProteinPrediction of secondary structure of TC0668 protein using Sopma software, blue for alpha helix,red for extended strand and purple for random coil.4.3 pGEX4T-1/tc0668 原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定4.3.1 tc0668 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果對 Cm 基因組中的 tc0668 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，取 4μL 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖所示，在大小約為 1227bp 位置可見清晰的特異性條帶，，與 tc0668 的預(yù)期片段大小相符。1500bpM 1 2
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R374

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳玉玉;吳移謀;劉良專;陳麗麗;張秋桂;;肺炎嗜衣原體Cpn0810重組蛋白誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和凋亡的研究[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年09期

2 賈天軍;劉殿武;羅建華;張庶民;鐘光明;;肺炎衣原體CPn0308的基因克隆及其內(nèi)源性蛋白定位的研究[J];衛(wèi)生研究;2008年02期

本文編號：2666560