【摘要】：神經(jīng)菌毛素1(Neuropilin1,NRP1)作為一種跨膜糖蛋白在軸突導(dǎo)向,血管生成和腫瘤免疫等多種反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),NRP1是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的非酪氨酸激酶受體,促進(jìn)VEGF與其受體(VEGFR)的結(jié)合,對血管生成具有極大的促進(jìn)作用,其中b1b2結(jié)構(gòu)域是其與VEGF165的主要結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn),NRP1高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面,尤其是上皮細(xì)胞腫瘤。阻斷NRP1不僅能直接對腫瘤細(xì)胞的遷移及腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生抑制作用,而且能夠阻斷其與VEGF165的結(jié)合,間接抑制腫瘤局部血管的生成與發(fā)展,繼而影響腫瘤的生長發(fā)展。因此,NRP1有望成為抗腫瘤治療的新突破點。本研究首先通過PCR技術(shù)得到人NRP1 b結(jié)構(gòu)域(HuNRP1b)的編碼序列,并將其克隆入原核表達(dá)載體,經(jīng)表達(dá)、純化后,獲得重組HuNRP1b蛋白;將重組HuNRP1b蛋白免疫小鼠,制備出抗HuNRP1b單克隆抗體(McAb)。隨后,采用體內(nèi)、體外實驗分析McAbs結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力及抑制血管生成的活性,為其后續(xù)的抗腫瘤研究提供基礎(chǔ)。一.重組HuNRP1 b結(jié)構(gòu)域蛋白的獲得利用PCR方法得到HuNRP1b的編碼基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-HuNRP1b,經(jīng)雙酶切和測序驗證后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中,構(gòu)建重組表達(dá)菌BL21(pET30a-HuNRP1b)。經(jīng)0.6 mM/L IPTG進(jìn)行低溫誘導(dǎo),SDS-PAGE分析融合蛋白His-HuNRP1b的表達(dá)。經(jīng)變性、復(fù)性、純化等步驟制備可溶的重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析,融合蛋白His-HuNRP1b成功獲得表達(dá)、純化,濃度約為3.0mg/ml。二.制備抗HuNRP1 b結(jié)構(gòu)域單克隆抗體并分析其生物學(xué)特性選取8wkBalb/c鼠,將上述獲得的純化蛋白His-HuNRP1b進(jìn)行小鼠腹部皮下免疫,100μg/只,免疫3次,間隔2wk。第一次免疫,將純化His-HuNRP1b與等體積完全弗氏佐劑混合,充分乳化后在小鼠腹部皮下進(jìn)行多點注射。再次免疫,佐劑更換為不完全弗氏佐劑,抗原、劑量、免疫途徑均同上。1wk后,取小鼠眼眶下靜脈叢血,檢測其血清效價,取效價高者進(jìn)行加強免疫。加強免疫時,采用尾靜脈直接注射不加任何佐劑的His-HuNRP1b。3 d后取免疫鼠脾臟,制備單細(xì)胞懸液,與sp2/0-Ag-14骨髓瘤細(xì)胞融合,ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株。將陽性雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過2-3次亞克隆后得到穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株,小鼠腹腔注射法制備腹水McAbs。采用Western-Blot、間接免疫熒光法(IFA)、細(xì)胞免疫化學(xué)(ICC)、免疫組織化學(xué)法(IHC)研究McAbs的生物學(xué)特性。本研究共獲得4株腹水McAbs,分別為1H4、2G7、3H4、8G9,它們的ELISA效價依次為 1:256 000、1:64 000、1:256 000、1:128 000,亞類分別為:IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b。Western-Blot鑒定結(jié)果顯示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)只與融合蛋白HuNRP1b結(jié)合而不與空載體表達(dá)菌結(jié)合,在36 kDa的位置出現(xiàn)特異性條帶;且該McAbs可以與高表達(dá)天然HuNRP1的乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7、BT474、SK-BR-3、MDA-MB-231)結(jié)合,在大小約120 kDa的位置有特異性條帶。表明本研究所獲得的McAbs不僅可以識別重組HuNRP1 b結(jié)構(gòu)域蛋白而且可以識別全長的HuNRP1。IFA結(jié)果表明,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)可以與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231、MCF-7)及人白血病細(xì)胞株(k562)結(jié)合,觀察到亮綠色熒光,表明所獲得的McAbs均能夠特異性識別天然的HuNRP1。ICC結(jié)果顯示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)作用于HUVEC細(xì)胞及MDA-MB-231細(xì)胞時,在胞膜及胞漿內(nèi)可見棕褐色信號,其中McAbs:2G7、3H4、8G9結(jié)合能力較強。4株McAbs采用IHC實驗分析臨床樣本的結(jié)果表明,在9例乳腺癌樣本中McAbs分析發(fā)現(xiàn)有6例呈HuNRP1陽性;7例肺癌樣本中有3例呈陽性;3例食管癌及3例腎癌均呈陽性,這與商品化的抗用HuNRP1抗體檢測結(jié)果一致。表明獲得的McAbs可以特異性識別腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織中的HuNRP1。三.抗HuNRP1 b結(jié)構(gòu)域單克隆抗體抑制血管生成活性的研究運用Transwell小室遷移實驗,分析McAbs對HUVEC細(xì)胞的遷移的影響。在小室的下室加入10ng/ml VEGF165,上室分別加入終濃度為50 ng/孔的McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)阻止細(xì)胞向下遷移,每組設(shè)三個復(fù)孔,同時設(shè)PBS組作為對照。實驗結(jié)果顯示,McAbs(1H4、2G7、8G9)相對于PBS組細(xì)胞遷移抑制率約為15%,3H4組未表現(xiàn)出抑制作用。運用Matrigel體外成管實驗分析McAbs對HUVEC細(xì)胞體外成管的影響,細(xì)胞接種后,每孔加入10 ng/ml VEGF165刺激細(xì)胞成管,實驗孔加入McAbs(1H4、2G7、8G9),50ng/孔,設(shè)PBS孔作對照,繼續(xù)培養(yǎng)6h,鏡下觀察細(xì)胞成管情況,發(fā)現(xiàn)PBS組的HUVEC細(xì)胞可以形成明顯管狀結(jié)構(gòu),而McAbs組大部分細(xì)胞仍附于Matrigel表面生長,抑制率約為10%,體外實驗表明McAbs(1H4、2G7、8G9)對于局部血管生成具有一定的抑制作用。利用雞胚尿囊膜血管生成實驗,進(jìn)一步分析McAbs對新生血管發(fā)生發(fā)展的影響。以硅膠環(huán)作為載體在健康發(fā)育的雞胚內(nèi)血管生長相對不豐富位置分別放入McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9),保持終濃度為100 ng/枚,同時設(shè)終濃度為100 μg/枚的地塞米松組作為陽性對照,設(shè)PBS100μL/枚作為陰性對照。結(jié)果顯示,McAbs(1H4、8G9)組及地塞米松組雞胚絨毛尿囊膜血管的生長受到了明顯的抑制,但McAbs(2G7、3H4)組抑制效果較不明顯。最后,采用SCID小鼠體內(nèi)種植Matrigel小體實驗研究McAb對動物體內(nèi)血管的生成的抑制作用。將100μgMcAb1H4、5×106MCF-7細(xì)胞與500μ1Matrigel混勻,于SCID小鼠腹部皮下注射。6天后取出小鼠體內(nèi)種植的Matrigel小體,觀察小體內(nèi)血管的發(fā)育情況,并對其進(jìn)行包埋、制成切片,通過蘇木素-伊紅(HE)染色及IHC方法進(jìn)一步分析Matrigel小體內(nèi)血管的發(fā)育。HE染色和IHC實驗發(fā)現(xiàn)McAb 1H4可以干擾Matrigel小體內(nèi)MCF-7細(xì)胞對小體內(nèi)血管生成的吸引作用。綜上所述,本研究成功制備出4株抗HuNRP1bMcAb,且具有識別天然HuNRP1的能力。其中,McAbs 1H4、2G7、8G9具有一定的體外抑制HUVEC遷移及成管能力,其中McAb 1H4具有體內(nèi)抑制腫瘤血管生成的能力。該特異性McAb的獲得為研究靶向抑制腫瘤部位血管生成及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了生物材料。
【圖文】：

３．１．１邐ＨｕＮＲＰｌ１）基因擴增逡逑以ＨｕＮＲＰｌ的全長ｃＤＮＡ作為模板利用設(shè)計的上下游引物采用ＰＣＲ技術(shù)擴增出逡逑ＨｕＮＲＰｌｂ的基因。結(jié)果如圖１－丨所示，泳道１中的大小約為９００邋ｂｐ左右的特異性條帶為目逡逑的條帶，且大小與ＧｅｎＢａｎｋ上公布的ＨｕＮＲＰ邋１ｂ基因序列大小相同表明成功擴增出ＨｕＮＲＰ邋１ｂ逡逑區(qū)基因。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋Ｉ逡逑�。�！■逡逑２５００逡逑０００邐＾＿逡逑．．沁逡逑２５０逡逑■■■■逡逑圖ｌ－ｌ．ＨｕＮＲＰｌｂ基因ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１．５％瓊脂糖凝膠電泳分析圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ＨｕＮＲＰ邋ｌｂ逡逑Ｍ．ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１．邋ＨｕＮＲＰｌｂ邋基因邋ＰＣＲ邋產(chǎn)物逡逑３．１．２重組質(zhì)粒ｐＥＴ３０ａ－ＨｕＮＲＰｌｈ的構(gòu)建逡逑３．１．２＿邋１重組質(zhì)粒ｐＥＴ３０ａ－ＨｕＮＲＰ邋１ｂ的雙酶切鑒定逡逑選擇上述菌液ＰＣＲ鑒定結(jié)果正確的菌液用小提試劑盒提取質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度后，進(jìn)逡逑行雙酶切鑒定。結(jié)果如圖１－２所示，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后鑒定后出現(xiàn)了兩個條帶，且其位置逡逑大小分R%與質(zhì)粒及目的基因一致，則選取該重組質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)逡逑行測序，序列比對的結(jié)采卜源性為１００邋％，表明重組質(zhì)粒ｐＥＴ３0ａ－ＨｕＮＲＰ邋１ｂ得到成功構(gòu)建。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１逡逑ｉ５000ＭＢ逡逑５000ＬＪＬ｜｜＾￣逡逑２５００逡逑２偏逡逑圖１－２．重姐質(zhì)粒ｐＥＴ３（３ａ－ＨｕＮＲＰｌｂ雙酶切鑒定圖逡逑

將重組質(zhì)粒ｐＥＴ３Ｑａ－ＨｕＮＲＰｌｂ重轉(zhuǎn)化入細(xì)菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受態(tài)菌，獲得重組表達(dá)菌逡逑ＢＬ２１邋（ｐＥＴ３Ｑａ－ＨｕＮＲＰｌｂ）。分別將該重組菌與空載體表達(dá)菌ＢＬ２１邋（ｐＥＴ３Ｑａ）經(jīng)０．６邋ｍＭ／Ｌ的逡逑ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結(jié)果如圖１－３所示，泳道２約３６邋ｋＤａ的位置有一條特異逡逑性條帶，其大小與目的蛋白的分子量大小相同，而經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后的空載體表達(dá)菌在這一逡逑位置沒有出現(xiàn)明顯條帶，，表明融合蛋白ＨｕＮＲＰｌｂ得到成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的逡逑方式存在。逡逑ｋＤａ邋Ｍ邋１邐２邐３邐４逡逑—■■邋■邋■－邋■邋■邋■邋邋：卜—辦．ｉ＇＇＇玫逡逑３０邋：：：邐．逡逑９５…＝逡逑４３邐？逡逑２６、“＇邋．．．．邋－逡逑圖邋１－３邋ＢＬ２１邋（ｐＥＴ３Ｑａ－ＨｕＮＲＰｌｂ）表達(dá)產(chǎn)物的邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋分析逡逑Ｆｉｇ．１－３邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ＨｕＮＲＰｌｂ邋ｉｎ邋ＢＬ２１邋（ＰＥＴ３０ａ－ＨｕＮＲＰｌｂ）邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＩＰＴＧ逡逑Ｍ．邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋ｌ．ＢＬ２１（ｐＥＴ３０ａ－ＨｕＮＲＰｌ
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392-33

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本文編號：2666264