【摘要】：腸道病毒71型(enterovirus71, EV71)可引起手足口病、嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥如無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫等,具有較高的病死率和致殘率。EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬,是單鏈正股RNA病毒,其正鏈的RNA基因組被翻譯成一個(gè)多聚蛋白,經(jīng)過自身剪切,最終形成結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4和非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。目前EV71的致病機(jī)理有待闡明。 EV712C蛋白含329個(gè)氨基酸,分別與同屬的柯薩奇病毒A16型和脊髓灰質(zhì)炎病毒的同源性達(dá)97.5%和63.3%,相對(duì)保守。NF-κB蛋白家族在宿主抵抗病毒感染過程中起著關(guān)鍵作用。在宿主細(xì)胞的正常生理狀態(tài)下,p65和p50與IκB-α/β在細(xì)胞質(zhì)中形成非活化狀態(tài)的三聚體,在受到外界多種信號(hào)刺激下,通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,IκB-α/β被降解,活化后的p65和p50二聚體從細(xì)胞質(zhì)中遷移到細(xì)胞核中,與細(xì)胞核中特異DNA序列結(jié)合,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄,引起細(xì)胞因子、趨化因子、粘附因子等表達(dá),使得宿主對(duì)病毒侵染產(chǎn)生天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。目前可通過自身蛋白抑帶NF-κB信號(hào)途徑的病毒有cowpox virus, coxsackieviruses, hepatitis C virus, HIV-1, poliovirus, SARS-coronavirus等。 我們通過酵母雙雜交方法以EV712C蛋白為誘餌進(jìn)行了大規(guī)模的酵母雙雜交篩選人cDNA文庫,得到其中一個(gè)候選蛋白是p65。我們通過免疫共沉淀和GST pull down技術(shù)證實(shí)了EV712C和p65相互作用,經(jīng)激光共聚焦觀察EV712C和p65在細(xì)胞內(nèi)存在共定位。為了明確與2C相互作用的p65蛋白區(qū)域,我們針對(duì)p65進(jìn)行了截短突變,最終將作用區(qū)域定位于194-290氨基酸p65的IPT結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域是p65與p50形成二聚體的結(jié)合區(qū)域,實(shí)驗(yàn)表明2C能通過與IPT結(jié)構(gòu)域相互作用削弱p65和p50的結(jié)合。為明確與p65的相互作用的2C蛋白區(qū)域,我們針對(duì)2C進(jìn)行了截短突變,將作用區(qū)域定位于105-125氨基酸和126-263氨基酸。通過NF-κB報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)105-125和126-263氨基酸片段都能抑制NF-κB舌化。我們將2C截?cái)嗤蛔凅w1-104,1-113,1-117,1-121,1-125氨基酸區(qū)段進(jìn)行了報(bào)告基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)五個(gè)突變體皆抑制NF-κB活化。據(jù)報(bào)道,2C1-125aa抑制IKKβ磷酸化而抑制NF-κB活化,我們采用免疫共沉淀方法,發(fā)現(xiàn)IKKβ與2C1-104和105-125氨基酸皆有作用,2C105-121氨基酸與IKKβ相互作用而不與p65IPT功能域相互作用。 綜上所述,我們首次鑒定了EV712C與p65相互作用,并闡明2C可通過與p65的IPT結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制p65和p50二聚體形成,提出了EV71拮抗天然免疫的新機(jī)制。
【圖文】：

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 博上學(xué)位論文構(gòu)，無包膜和突起，直徑約24-30 nni。EV71病毒基因組編碼的VP1、VP2、VP3、VP4四個(gè)多肽構(gòu)成原聚體，原聚體經(jīng)拼裝成為具有五聚體樣結(jié)構(gòu)的亞單位，60個(gè)亞單位通過各自結(jié)構(gòu)域相互連接，最終形成病毒的外殼，，VP1、VP2、VP3三個(gè)多肽暴露在病毒外殼表面，而VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密相連[17]。Wang等人于2012年解析/ EV71衣殼蛋白的晶體結(jié)構(gòu)[18]。

1.1.2基因組結(jié)構(gòu)EV71基因組約7400個(gè)核苷酸的單股正鏈RNA，病毒的單鏈RNA具有感染性。病毒基因組兩端為保守的非編碼區(qū)（UTR)，5’末端共價(jià)結(jié)合一個(gè)小分子蛋白Vpg,與病毒RNA合成和基因組裝配有關(guān)。在3’末端有多聚腺甘酸（polyA)尾，如果去除3’末端多聚腺甘酸（polyA)尾或基因組出現(xiàn)斷裂，感染性消失，而5’末端共價(jià)連接的蛋白對(duì)病毒的感染性沒有明顯影響[20]。EV71基因組僅有一個(gè)^u放閱讀框，編碼含2194個(gè)氨基酸的多聚蛋白(polyprotein)。在多聚蛋白合成的同時(shí)，被自身蛋白酶切割繼而產(chǎn)生PI、P2-P3兩個(gè)前體蛋白。P1前體蛋白經(jīng)過進(jìn)一步加工，最終形成VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)形成病毒外殼的結(jié)構(gòu)蛋白。P2-P3前體蛋白被進(jìn)一步切割和加工，最終形成7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白形成的外殼蛋白與復(fù)制的病毒RNA包裝成成熟的病毒顆粒，7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白雖然不是病毒顆粒的組成部分，但在病毒侵染和復(fù)制過程中發(fā)揮非常重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2666341