【摘要】：目的構(gòu)建解脲脲原體UP3_c0006基因原核表達(dá)載體并表達(dá)蛋白。方法根據(jù)NCBI上公布的解脲脲原體UP3_c0006基因序列設(shè)計上、下游引物,以解脲脲原體基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因,采用經(jīng)酚氯仿法回收、純化。BamHI和NotI酶分別對目的基因和原核表達(dá)載體pGEX-6P-2進(jìn)行雙酶切,酶切片段在T4連接酶作用下連接,連接產(chǎn)物經(jīng)熱休克法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌XL1-Blue。轉(zhuǎn)化菌接種至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),進(jìn)行菌落PCR篩選及測序驗證。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌用IPTG誘導(dǎo)3h,超聲裂解菌體經(jīng)GST Sepharose 4B親和層析純化融合蛋白GST-UP3_c0006并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果 PCR擴(kuò)增UP3_c0006基因片段長327bp,構(gòu)建的UP3_c0006原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化XL1-Blue后進(jìn)行菌落PCR鑒定,目的片段約為477bp,與預(yù)期相符。對重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進(jìn)行基因測序,結(jié)果與NCBI中UP3_c0006基因序列完全一致;誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白純化后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,融合蛋白GST-UP3_c0006分子質(zhì)量單位約為38×103,與預(yù)期相符。結(jié)論成功構(gòu)建了pGEX-6P-2-UP3_c0006原核表達(dá)載體,并在大腸埃希菌中獲得融合蛋白的表達(dá),該蛋白主要存在于重組菌超聲裂解上清中。

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