【摘要】：背景:哺乳動物精子在睪丸中發(fā)生發(fā)育并在附睪中成熟后,并不完全具有授精能力。當(dāng)精子進(jìn)入雌(女)性生殖道后,理化環(huán)境的改變激發(fā)精子的獲能、超活化、趨化性和頂體反應(yīng)等重要生理功能,使得精子與卵細(xì)胞成功受精。研究表明,卵泡液、卵丘細(xì)胞分泌液和透明帶都能夠誘導(dǎo)和激活精子上述重要生理功能。孕酮是卵泡液和卵丘細(xì)胞分泌液中的有效成份之一,能夠在短時間內(nèi)引起鈣離子內(nèi)流和氯離子外流,同時增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)化腺核苷酸含量,調(diào)節(jié)精子的獲能、頂體反應(yīng)、超活化和趨化性等重要生理功能。因以上孕酮介導(dǎo)的效應(yīng)不通過調(diào)控基因表達(dá)實現(xiàn),故被稱為人精子孕酮非基因組效應(yīng)。近年來,主流觀點認(rèn)為孕酮是通過激活人精子特異性鈣通道CatSper引起鈣信號的變化來實現(xiàn)對精子相關(guān)生理功能的調(diào)控,但目前關(guān)于孕酮是否直接作用于CatSper仍存在較多爭議。最近Miller等人的研究發(fā)現(xiàn)孕酮在活化人精子質(zhì)膜上的水解酶ABHD2后,ABHD2繼而可以水解人精子膜上抑制CatSper通道開放的大麻素2-AG,并最終導(dǎo)致CatSper通道激活,這提示孕酮并不是通過直接結(jié)合CatSper通道激活其鈣電流。然而,尚缺少更為直接的證據(jù)證實ABHD2是人精子孕酮受體。孕酮-脂聯(lián)素受體(progestin adiponectin Q receptor,PAQR)屬于一類新命名的膜蛋白受體家族,其成員具有G蛋白偶聯(lián)受體類似的7次跨膜結(jié)構(gòu)域。目前該家族在人類中有11個成員,包括孕酮受體和脂聯(lián)素受體兩個亞群。其中,人孕酮-脂聯(lián)素受體7(hPAQR7,亦被稱作mPRα)屬于PAQR家族中的孕酮受體亞群,主要在卵巢和睪丸等生殖相關(guān)組織中表達(dá)。同位素標(biāo)記的孕酮結(jié)合實驗結(jié)果表明hPAQR7與孕酮的結(jié)合具有高親和性飽和性特異性和可逆性等特征,符合孕酮受體的特點。最為重要的是,在人成熟精子細(xì)胞膜上中能檢測到hPAQR7蛋白,主要定位在精子尾部,且其功能可能與人成熟精子運動有關(guān)。然而,作為人精子中孕酮膜受體的理想候選蛋白,hPAQR7在人成熟精子響應(yīng)孕酮過程中所起作用及其機制尚不清楚。實驗?zāi)康?本文旨在揭示hPAQR7介導(dǎo)人成熟精子響應(yīng)孕酮的作用和機制,補充和完善現(xiàn)有孕酮對人精子CatSper激活機制,并為男性不育診療提供新的分子靶標(biāo)。實驗方法:1)免疫組化檢測hPAQR7在成年人和老年人睪丸中的表達(dá)和分布情況;2)反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印跡檢測人成熟精子中是否存在hPAQR7的轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì);3)親和素親和層析和超高分辨顯微技術(shù)驗證孕酮與人精子中hPAQR7的結(jié)合并進(jìn)一步檢測孕酮-hPAQR7在人精子中的結(jié)合部位;4)精子穿透甲基纖維素實驗評價人精子超活化運動能力;5)金霉素染色(CTC)評價人精子發(fā)生頂體反應(yīng)的概率;6)單細(xì)胞鈣成像系統(tǒng)檢測人精子胞內(nèi)鈣濃度變化情況;7)Western blotting定量分析人精子中hPAQR7含量;8)超分辨顯微技術(shù)檢測孕酮與hPAQR7在人精子中的結(jié)合部位;9)免疫熒光驗證hPAQR7、CatSper、ABHD2在人精子中的共定位;10)精子膜片鉗技術(shù)記錄hPAQR7抗體對孕酮激活人精子CatSper通道電流的影響;11)免疫共沉淀技術(shù)驗證hPAQR7、CatSper、ABHD2是否存在相互作用。結(jié)果:1)hPAQR7主要表達(dá)在人睪丸生殖細(xì)胞中,越靠近腔體的生殖細(xì)胞中表達(dá)越高,且老年人睪丸中hPAQR7含量降低,提示hPAQR7可能與精子功能有關(guān);2)人成熟精子中能檢測到hPAQR7轉(zhuǎn)錄本和蛋白,且hPAQR7為膜蛋白,主要定位于精子尾部;3)孕酮結(jié)合于人精子頭部和尾部,hPAQR7能結(jié)合孕酮且結(jié)合孕酮的hPAQR7主要分布在人精子尾部;4)針對hPAQR7膜外段設(shè)計的hPAQR7單克隆抗體能顯著抑制孕酮對人精子胞內(nèi)鈣含量增加以及對CatSper電流的激活效應(yīng),這提示hPAQR7可能通過介導(dǎo)孕酮激活CatSper通道所導(dǎo)致的鈣信號變化,最終影響孕酮對人精子功能的調(diào)控過程;5)免疫共沉淀實驗結(jié)果表明hPAQR7抗體可以與CatSper及ABHD2受體形成免疫復(fù)合物,此結(jié)果表明hPAQR7與CatSper、ABHD2受體間存在相互作用,而這進(jìn)一步暗示hPAQR7-CatSper-ABHD2在人精子中形成復(fù)合物調(diào)控人精子孕酮非基因組效應(yīng);6)臨床樣本篩查結(jié)果表明,男性不育病人中有42%病例精子響應(yīng)孕酮能力下降(鈣信號和CatSper電流),且在這些男性不育病例中50%以上hPAQR7含量降低。這表明hPAQR7含量降低在精子響應(yīng)孕酮能力下降類男性不育癥中扮演重要角色。結(jié)論:綜上所述,我們認(rèn)為hPAQR7在介導(dǎo)人成熟精子響應(yīng)孕酮過程中起到重要作用,且可能通過孕酮-hPAQR7-ABHD2-CatSper這一調(diào)控機制介導(dǎo)人精子孕酮非基因組效應(yīng)。
【圖文】：

第 1 章 引言物附睪中精子成熟后，一旦進(jìn)入雌性生殖道后，便致力于完成精卵結(jié)合過程此時并不是每個精子都具有成功受精的能力，僅有少數(shù)精子能夠在接受到生殖道環(huán)境內(nèi)的某些生理因子的刺激后發(fā)生獲能過程[6]�，F(xiàn)已有大量研究表精子進(jìn)行獲能過程中伴隨著 Ca2+濃度的增加、可溶性腺苷酸環(huán)化酶、酪氨酸化、PKA 和 PKC 等水平的升高[7-11]。其中，，精子鈣濃度的改變以及蛋白水變化被認(rèn)為對精卵結(jié)合過程具有重要作用。精子在獲能后，其運動方式逐漸變化，例如鞭毛鞭打的頻率及幅度增加，鞭打方式由對稱，高頻，低幅轉(zhuǎn)變對稱，低頻，高幅度，即超活化運動[12]。精子的這類超活化運動可以確保精有充足的動力穿過卵細(xì)胞的透明帶。在精卵結(jié)合的過程中，精子將會發(fā)生有其受精的頂體反應(yīng)，使得其細(xì)胞核可以進(jìn)入卵細(xì)胞中并最終順利完成整個過程。哺乳動物受精過程如圖 1.1。

第 1 章 引言應(yīng)等）[13]，因此，孕酮是調(diào)節(jié)精子功能的重要生理激素，且精子對孕酮的正常響應(yīng)能力是精子成功受精的重要保障。目前，關(guān)于孕酮調(diào)控精子功能的具體機制亦得到了廣泛的研究。一般認(rèn)為，由于成熟精子是核基因轉(zhuǎn)錄沉默的特化細(xì)胞，故孕酮對成熟精子的作用被稱為非基因組效應(yīng)（non-genomic progesterone actions）[14]。研究表明在哺乳動物成熟精子中沒有檢測到孕酮核受體（nPR，nucleaprogestin receptor），并且 nPR 的抑制劑和轉(zhuǎn)錄抑制劑并不能阻斷孕酮對精子的作用[15,16]。因此，孕酮的非基因組效應(yīng)不是由傳統(tǒng)的孕酮核受體介導(dǎo)的，而主要是通過激活精子上的膜孕酮受體（mPR，membraneprogestinreceptor）從而調(diào)控其下游的信號通路來實現(xiàn)的，因此這種效應(yīng)不會改變細(xì)胞核的基因表達(dá)。長期以來，不同的研究小組嘗試從精子細(xì)胞膜中篩選孕酮結(jié)合蛋白，但現(xiàn)階段仍缺少充分的實驗證據(jù)來證明這些蛋白是孕酮膜受體[16-18]。因此，至今為止孕酮調(diào)控精子功能的具體有關(guān)機制尚不完全清晰。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R321

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1 彭真;hPAQR7介導(dǎo)人成熟精子響應(yīng)孕酮的作用和機制[D];南昌大學(xué);2018年

本文編號：2663118