【摘要】：研究背景及目的過(guò)敏性疾病主要導(dǎo)致自身生理功能紊亂,并伴有血清中免疫球蛋白E(Immunoglobin E,IgE)的升高,如過(guò)敏性鼻炎,哮喘等,該類紊亂性疾病在近10年內(nèi)急劇增長(zhǎng),幾乎已經(jīng)達(dá)到近流行病的比例~([1])。磷脂酰肌醇激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)在B淋巴細(xì)胞的類別轉(zhuǎn)換中具有重要的調(diào)節(jié)作用。配對(duì)盒蛋白5(Paired box protein 5,Pax5)在B細(xì)胞發(fā)展成熟的早期階段是一種重要的調(diào)節(jié)因子,在早期可以表達(dá)B細(xì)胞特異性活化蛋白BSAP(B-cell lineage specific activator protein,BSAP)。它的異常表達(dá)也可能導(dǎo)致機(jī)體淋巴瘤的產(chǎn)生。該分子的存在對(duì)抗體轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用。但是PI3K對(duì)IgE轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制還沒(méi)有被探索,因此本研究旨在于探索PI3K信號(hào)通路在IgE類別轉(zhuǎn)換作用以及與Pax5等轉(zhuǎn)錄因子的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。方法1)選取RPMI8266和U266兩種人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,選取PI3K的兩種不同活性抑制劑LY294002,PIK-293提前作用于上述兩種細(xì)胞1h后,給予對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組同時(shí)刺激IL-4(50ng/ml)和anti-CD40(1μg/ml)抗體2d,提取RNA,通過(guò)QPCR測(cè)定AID和εGLT的表達(dá)量,同時(shí)通過(guò)流式單染試驗(yàn)測(cè)IgE的表達(dá)比例,判定兩種抑制劑對(duì)IgE產(chǎn)生的有效性。2)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行PI3K的抑制(15μM的LY294002),p-AKT的抑制(20μM的PHT-427)以及兩種抑制劑同時(shí)抑制處理,1h后給予對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組同時(shí)刺激IL-4(50ng/ml)和anti-CD40(1μg/ml)抗體2d,提取細(xì)胞的RNA,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定AID和εGLT的表達(dá)量,來(lái)判斷PI3K通路對(duì)Ig E的抗體轉(zhuǎn)換是否通過(guò)p-AKT。3)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行PI3K siRNA,Pax5 siRNA以及兩種siRNA的混合轉(zhuǎn)染處理,6h后給予結(jié)果對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組同時(shí)刺激IL-4(50ng/ml)和anti-CD40(1μg/ml)抗體2d,提取細(xì)胞的RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定AID和εGLT的表達(dá)量,同時(shí)測(cè)定上清IgE的濃度,來(lái)判斷PI3K對(duì)IgE的抗體轉(zhuǎn)換是否通過(guò)Pax5蛋白分子的作用。4)選取C57B/L雌鼠20只,分為對(duì)照組,4mg/kgLY294002處理組,所有小鼠提前一周買回來(lái)放動(dòng)物房穩(wěn)定,一周后給予每只小鼠腹腔注射OVA和AL(OH)_3混合PBS溶液100ul,一周之后處理組小鼠每只小鼠每天按照4mg/kgLY294002的濃度腹腔注射,一周和兩周之后取小鼠脾臟和眼球取血,脾臟平分一半放入4%的多聚甲醛保存做免疫組化,另一半-80℃保存,通過(guò)免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證Pax5的表達(dá)在PI3K通路中的作用。結(jié)果1)通過(guò)流式,實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)AID,εGLT的測(cè)定,我們選出對(duì)PI3K活性抑制效果好的抑制劑LY294002。2)ELISA實(shí)驗(yàn),流式測(cè)定IgE+B細(xì)胞的比例,我們發(fā)現(xiàn)LY294002對(duì)Ig E的產(chǎn)生具有濃度依賴的特性(P0.05);通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)抑制劑LY294002對(duì)PI3K活性的抑制也有濃度依賴的特征(P0.05)。3)通過(guò)PI3K抑制劑LY294002,AKT的抑制劑以及兩種抑制劑共同抑制,實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)AID,εGLT的測(cè)定,我們發(fā)現(xiàn)PI3K對(duì)IgE的抗體轉(zhuǎn)化并不通過(guò)p-AKT這個(gè)分子(P0.05);LY294002濃度梯度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在IgE產(chǎn)生的過(guò)程中Pax5分子的表達(dá)上調(diào)。4)通過(guò)對(duì)兩種人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞用PI3K-siRNA,Pax5-siRNA的轉(zhuǎn)染以及共轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染的效果在兩個(gè)單獨(dú)轉(zhuǎn)染之間(P0.05),可以假設(shè)PI3K活性的抑制對(duì)IgE的轉(zhuǎn)換作用可能是通過(guò)Pax5分子。5)用LY294002對(duì)小鼠制作急性致敏模型,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的血清IgE的含量要高(n=10,F=107.463,P0.01),免疫組化發(fā)現(xiàn)Pax5分子比對(duì)照組表達(dá)量升高(P0.05),抑制因子Id2的表達(dá)量降低(P0.05)。結(jié)論P(yáng)I3K活性的抑制可以增強(qiáng)IgE的類別轉(zhuǎn)換,并且通過(guò)控制Pax5分子的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)IgE的生成。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 丘雅維;楊惠玲;;PI3K通路及其抑制劑抗腫瘤的研究進(jìn)展[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2009年S3期

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本文編號(hào)：2662839