發(fā)布時間：2020-05-13 18:47

【摘要】：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一種可引起嚴(yán)重下呼吸道疾病的最重要的病原體之一,易感人群為嬰幼兒、老年人及免疫缺陷者。2周歲以下的嬰幼兒均感染過RSV,每年有2.5-4%的嬰幼兒因感染RSV而住院,給全球衛(wèi)生醫(yī)療事業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。RSV至今缺乏安全有效的疫苗,Palivizumab(Synagis(?))是唯一一株經(jīng)過美國FDA批準(zhǔn)上市的用于RSV預(yù)防藥物。但是由于其效價不足、使用劑量高、價格昂貴,該抗體僅僅被用于免疫缺陷及先天性心臟病等高危新生兒預(yù)防RSV的感染。20世紀(jì)60年代研究者們?yōu)轭A(yù)防RSV的感染向一部分嬰幼兒使用了針對RSV的福爾馬林滅活全病毒疫苗(FI-RSV)。然而當(dāng)受試兒童再次暴露于RSV后,急性下呼吸道感染的頻率和嚴(yán)重程度顯著增加并最終導(dǎo)致受試者中兩名幼童發(fā)生死亡,這種增強的RSV疾病稱之為ERD(enhanced RSV disease)。之后的數(shù)十年間,各種疫苗設(shè)計策略被應(yīng)用于RSV疫苗研究中,許多亞單位、減毒、基因工程備選疫苗紛紛進入臨床,但始終未能獲得成功。在RSV病毒表面的兩個主要膜蛋白G蛋白和F蛋白被認(rèn)為是最主要的誘導(dǎo)中和抗體應(yīng)答的免疫原,其中G蛋白在不同型別間存在較大的差異,而F蛋白則較為保守,因此F蛋白一直是疫苗研究的最主要的靶標(biāo),針對F蛋白的抗體Palivizumab的成功應(yīng)用也進一步的支持了這一觀點。隨著對F蛋白結(jié)構(gòu)的深入解析,研究者發(fā)現(xiàn)RSV的F蛋白存在兩種構(gòu)象,即pre-fusion構(gòu)象和post-fusion構(gòu)象,Palivizumab所識別的表位在兩種構(gòu)象上均有分布,而特異性識別pre-fusion構(gòu)象的抗體則展示出比Palizivumab高10-100倍的體外中和效價,這表明pre-fusion構(gòu)象的F蛋白是誘導(dǎo)中和抗體應(yīng)答的更為主要的靶構(gòu)象。通過基因工程改造的較為穩(wěn)定的pre-fusion F蛋白免疫后的誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答也明顯優(yōu)于post-fusion F蛋達2-4倍。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)二十世紀(jì)60年代失敗的FI-RSV疫苗,其病毒表面F蛋白則主要為post-fusion構(gòu)象,這表明FI-RSV無法有效誘導(dǎo)出針對RSV的高效中和抗體,因此推斷FI-RSV失敗的原因很可能是由于免疫后所誘導(dǎo)的弱中和抗體無法有效抑制RSV的感染,同時這些弱中和抗體結(jié)合復(fù)制產(chǎn)生的病毒產(chǎn)生了大量的免疫復(fù)合物并堆積在呼吸道引起疾病增強。相比于其他疫苗類型,全病毒滅活疫苗呈遞的抗原表位最全面且最接近天然狀態(tài),因此在本研究中我們希望嘗試探索出合適的滅活條件和疫苗保存條件以最大程度地保留病毒表面pre-F蛋白。結(jié)果顯示出在天然RSV病毒表面,pre-fusion構(gòu)象的F蛋白的極不穩(wěn)定的,在4℃下放置72 h后病毒表面的大部分pre-fusion構(gòu)象會消失,F蛋白主要以post-fusion構(gòu)象存在。而當(dāng)使用濃度為0.2667%-0.0156%的甲醛滅活12h后,病毒表面有40%-60%的pre-fusionF蛋白被保留下來,并且在放置72h后檢測依然維持這一比例。而在未經(jīng)甲醛滅活病毒表面,pre-fusionF蛋白在相同條件下保留不足20%。這表明在合適的濃度下,甲醛在滅活病毒的過程中,能夠同時穩(wěn)固病毒表面的pre-fusion F蛋白。我們同時發(fā)現(xiàn)在FI-RSV的處理條件下(甲醛終濃度為0.01%)無法穩(wěn)固pre-fusion F蛋白,72 h滅活后病毒表面的F蛋白主要為post-fusion構(gòu)象。此外,我們還發(fā)現(xiàn)在330mM以上的鹽離子溶液中也有利于病毒表面pre-fusionF蛋白的穩(wěn)定,但不會穩(wěn)固pre-fusionF蛋白,去除高鹽溶液后pre-fusion F蛋白依然會逐步降低,這表明330mM以上的鹽離子溶液可以作為有效的保藏條件使用。因此本研究結(jié)合優(yōu)選的滅活條件和保存條件最終獲得的滅活病毒最終能夠維持表面80%-90%的pre-fusion F蛋白。進一步的小鼠免疫評估結(jié)果顯示,從免疫后血清中和抗體水平中發(fā)現(xiàn),相同免疫劑量下優(yōu)選條件的中和抗體水平大約是FI-RSV組4-5倍升高,并且所有免疫劑量下小鼠血清中和抗體水平均能達到保護感染的有效的血清中和抗體水平。在隨后的攻毒結(jié)果也顯示出,陽性組和FI-RSV組在攻毒后第7天均有明顯的體重下降,大約下降了 20%左右,而優(yōu)選條件組除了在低劑量免疫組第2天有輕微的體重下降外,其余免疫組體重均保持95%以上;同時在攻毒后鼻肺部病毒滴度檢測結(jié)果中也顯示,除了對照組其余均沒有明顯的病毒檢出;后期我們還對小鼠肺組織進行炎癥病理評估,從肺部病理切片以及肺部炎癥量化結(jié)果來看,優(yōu)選疫苗組的炎癥均弱于對照組和FI-RSV組,這表明優(yōu)選疫苗免疫后能夠很好地保護小鼠抵抗RSV感染,減輕RSV感染造成的肺部炎癥。綜上所述,我們最終希望將探索得到的優(yōu)選條件和評估結(jié)果可以為RSV疫苗的研發(fā)提供扎實的理論和實踐基礎(chǔ)。
【圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＳＶ邋ｖｉｒｏｎ邋ＥＦ邋ＳＥＭ逡逑１．３呼吸道合胞病毒的基因組和編碼蛋白逡逑ＲＳＶ基因組（圖１－２）為單股非節(jié)段的負(fù)義鏈ＲＮＡ，全長１５，１９１－１５，２２６核苷逡逑酸（ｂｐ）。如果將ＲＳＶＡ２邋（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．Ｍ７４５６８）是ＲＳＶＡ亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株，，轉(zhuǎn)逡逑錄１０個基因（從３’至５’端依次為ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２、Ｌ），逡逑共編碼１１種蛋白，除了Ｍ２基因編碼兩種蛋白，分別是Ｍ２－１、Ｍ２－２，除此以外逡逑每個基因只編碼一種蛋白。其中Ｆ邋（融合蛋白）、Ｇ邋（黏附蛋白）、ＳＨ邋（小疏水逡逑蛋白）為跨膜糖蛋白，Ｍ、Ｍ２－１、Ｍ２－２為基質(zhì)蛋白，Ｎ邋（核殼蛋白）、Ｐ邋（磷酸逡逑蛋白）、Ｌ邋（大聚合酶蛋白）為核衣殼蛋白，ＮＳ１、ＮＳ２為非結(jié)構(gòu)蛋白。逡逑Ａ逡逑ＮＳ２邐ＳＨ邐Ｍ２＊１邋Ｍ２－２邐．逡逑．ＮＳ１邋Ｎ邋Ｐ邋Ｍ邋Ｇ邋Ｆ邋？ｓＦ逡逑３邋ｔｒ逡逑Ｉ邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１￣，＾邋１邋ｈ逡逑０邐２邋４邐６邐８邐１０邐１５邋ｋｂ逡逑３逡逑

ＭＬ逡逑＾ＳＳＢＲＢＨＢＰｉ■■畫邋ＡＩＢＨＨＩＨｉＨＢ逡逑圖１－１呼吸道合胞病毒病毒粒子及電鏡觀察結(jié)果１９１逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＳＶ邋ｖｉｒｏｎ邋ＥＦ邋ＳＥＭ逡逑１．３呼吸道合胞病毒的基因組和編碼蛋白逡逑ＲＳＶ基因組（圖１－２）為單股非節(jié)段的負(fù)義鏈ＲＮＡ，全長１５，１９１－１５，２２６核苷逡逑酸（ｂｐ）。如果將ＲＳＶＡ２邋（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．Ｍ７４５６８）是ＲＳＶＡ亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株，轉(zhuǎn)逡逑錄１０個基因（從３’至５’端依次為ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２、Ｌ），逡逑共編碼１１種蛋白，除了Ｍ２基因編碼兩種蛋白，分別是Ｍ２－１、Ｍ２－２，除此以外逡逑每個基因只編碼一種蛋白。其中Ｆ邋（融合蛋白）、Ｇ邋（黏附蛋白）、ＳＨ邋（小疏水逡逑蛋白）為跨膜糖蛋白，Ｍ、Ｍ２－１、Ｍ２－２為基質(zhì)蛋白，Ｎ邋（核殼蛋白）、Ｐ邋（磷酸逡逑蛋白）、Ｌ邋（大聚合酶蛋白）為核衣殼蛋白，ＮＳ１、ＮＳ２為非結(jié)構(gòu)蛋白。逡逑Ａ逡逑ＮＳ２邐ＳＨ邐Ｍ２＊１邋Ｍ２－２邐．逡逑．ＮＳ１邋Ｎ邋Ｐ邋Ｍ邋Ｇ邋Ｆ邋？ｓＦ逡逑３邋ｔｒ逡逑Ｉ邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１邋１￣，＾邋１邋ｈ逡逑０
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 葛小麗;陳洪敏;程娟娟;高明珠;過毅;;無錫地區(qū)340例呼吸道病毒感染患兒的病原學(xué)分析[J];臨床與病理雜志;2015年01期

2 Bernhard Resch;;Burden of respiratory syncytial virus infection in young children[J];World Journal of Clinical Pediatrics;2012年03期

3 謝健屏,常汝虛,何翠娟,謝集明,賴桂香,萬根平;1978～1996年廣州地區(qū)呼吸道合胞病毒感染分析[J];中華兒科雜志;1997年08期

本文編號：2662383