【摘要】：女性盆底功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction,PFD)是由于盆底支持結(jié)構(gòu)薄弱及損傷所引起的一組疾病,主要包括壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)、盆腔器官脫垂(pelvic orgen prolapse,POP)。盆底支持結(jié)構(gòu)主要由肌肉、韌帶、筋膜和神經(jīng)組成,相互連接成一個(gè)復(fù)雜、動(dòng)態(tài)和協(xié)調(diào)的系統(tǒng),保護(hù)盆底臟器,為排尿功能、排便功能、性功能等功能提供了基本保障。盆底任何部分的損傷都會(huì)導(dǎo)致其功能受損,這時(shí)就會(huì)出現(xiàn)一系列有關(guān)的臨床癥狀。隨著人口的老齡化,盆底疾病的發(fā)病率預(yù)計(jì)將急劇上升。肌肉的損傷被認(rèn)為是盆底功能障礙疾病發(fā)生的第一個(gè)也是最重要的原因,因?yàn)樗膹?qiáng)度減弱,使盆腔臟器發(fā)生移位,進(jìn)而出現(xiàn)功能異常。對(duì)于PFD的治療有兩種,非手術(shù)治療和手術(shù)治療,都有其不足之處,所以,需要一種新的方法使損傷盆底肌肉恢復(fù)其正常結(jié)構(gòu)和功能。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展,為盆底肌肉修復(fù)提供了新的手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因具有兩種重要特性:自我復(fù)制,向多種細(xì)胞系分化的能力,比如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等,成為組織工程學(xué)種子細(xì)胞,且取材方便,這些特點(diǎn)為其在修復(fù)盆底肌肉、治療PFD方面提供了理論依據(jù)。目的探索在體外條件下如何誘導(dǎo)BMSCs成肌分化。因此,本實(shí)驗(yàn)中我們采用BMSCs與正常及機(jī)械牽張后的大鼠盆底肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞分別間接共培養(yǎng)的方法,研究體外條件下誘導(dǎo)BMSCs成肌分化。研究方法(1)利用密度梯度離心法獲得大鼠BMSCs,純化傳代培養(yǎng)。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)與流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原表達(dá)的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化證明其分化潛能。(2)利用酶消化法獲得肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞,純化傳代培養(yǎng),通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)和常規(guī)免疫熒光檢測(cè)Desmin的表達(dá)進(jìn)行鑒定。(3)取第3代80%融合的大鼠肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞,分別負(fù)載10%形變,1Hz單向水平牽張刺激0、6、12 h。通過(guò)鬼筆環(huán)肽染色觀察不同時(shí)間牽張后肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞骨架。(4)將大鼠BMSCs與未牽張及牽張12h后的大鼠盆底肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞間接共培養(yǎng)6天,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)BMSCs中MyoD和Desmin mRNA的表達(dá);采用免疫蛋白印記(Western-blot)檢測(cè)BMSCs中MyoD和Desmin蛋白的表達(dá)。使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,數(shù)據(jù)均采用?x±s表示。用one-way ANOVA檢驗(yàn)樣本與對(duì)照組的組間差異,以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果(1)第四代BMSCs多為漩渦狀或平行排列生長(zhǎng),形態(tài)較為均一。CD34(1.8%)和CD45(3.7%)分子為陰性表達(dá),CD44(98.8%)和CD90(99.0%)為陽(yáng)性表達(dá)。且所得細(xì)胞可以被誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。(2)獲得的大鼠的盆底肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞胞體細(xì)長(zhǎng),呈梭形,大小和形態(tài)均一,排列均勻有序,折光性較強(qiáng)。細(xì)胞培養(yǎng)至第3代,Desmin免疫熒光檢測(cè)呈陽(yáng)性表達(dá),符合大鼠的盆底肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞特征。(3)顯微鏡下觀察染色的衛(wèi)星細(xì)胞骨架情況,結(jié)果顯示:肌動(dòng)蛋白纖維(F-actin)紅色熒光染色強(qiáng),分布均勻。機(jī)械牽張后,F-actin紅色熒光分布仍均勻、整齊,但強(qiáng)度減弱,且隨機(jī)械牽張時(shí)間的延長(zhǎng),紅色熒光強(qiáng)度的減弱更加明顯,細(xì)胞變狹長(zhǎng)。(4)RT-PCR和Western-blot檢測(cè)不同共培養(yǎng)體系中BMSCs MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示::與對(duì)照組相比,共培養(yǎng)組和機(jī)械牽張共培養(yǎng)組BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表達(dá)量均增高(P0.05);與共培養(yǎng)組相比,機(jī)械牽張共培養(yǎng)組BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表達(dá)量增高(P0.05)。結(jié)論(1)BMSCs與正常盆底肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞和機(jī)械牽張后的盆底肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞間接共培養(yǎng)均可誘導(dǎo)BMSCs成肌分化。(2)與機(jī)械牽張后的盆底肛提肌衛(wèi)星細(xì)胞間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)BMSCs成肌分化的作用更強(qiáng)。
【圖文】：

圖 3.2 第四代大鼠 BMSCs 表面抗原分子的表達(dá)a：CD34；b：CD45；c：CD44；d：CD903.1.3 成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果茜素紅染色結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)后，，形成了明顯的橘紅色結(jié)節(jié)（鈣鹽與茜素紅形成），說(shuō)明所得細(xì)胞可以被誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。（圖 3.3）

圖 3.2 第四代大鼠 BMSCs 表面抗原分子的表達(dá)a：CD34；b：CD45；c：CD44；d：CD90誘導(dǎo)分化結(jié)果染色結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)后，形成了明顯的橘紅色結(jié)節(jié)，說(shuō)明所得細(xì)胞可以被誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。（圖 3.3）c
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2661986