【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是目前僅次于阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease,AD)的全球第二大神經(jīng)退行性疾病,其主要病理特征包括中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失、神經(jīng)元中路易小體(Lewy body)沉積以及膠質(zhì)細(xì)胞活化。PD病人臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、肌肉僵直和運動障礙等。目前的研究認(rèn)為興奮性毒性、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及神經(jīng)炎癥等在PD的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用,然而確切的發(fā)病機制至今尚未闡明。雖然發(fā)病機制的多樣性制約著PD治療學(xué)的發(fā)展,但找尋能夠緩解多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退變的分子靶標(biāo),一直是研發(fā)理想PD治療藥物的重要目標(biāo)。近年來的研究表明,線粒體功能障礙是PD中導(dǎo)致DA神經(jīng)元死亡的重要原因。神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能障礙會直接影響腦內(nèi)能量代謝,并且造成活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的大量產(chǎn)生,加重氧化應(yīng)激。此外,受損線粒體還會釋放凋亡誘導(dǎo)因子,激活凋亡通路,從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。Pink1(PTEN induced putative kinase 1)是帕金森病發(fā)病的關(guān)鍵基因之一,其突變會導(dǎo)致早發(fā)性常染色體隱性遺傳帕金森綜合征(autosomal recessive early-onset Parkinson's disease),它同時也是與線粒體功能密切相關(guān)的一個基因。Pink1蛋白由581個氨基酸構(gòu)成,包含線粒體目標(biāo)信號和跨膜序列,是一種靶向于線粒體的的絲/蘇氨酸蛋白激酶。大量研究表明,Pink1在維持細(xì)胞線粒體功能和穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)線粒體自噬(Mitophagy)、保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡等方面發(fā)揮重要的作用,基因敲除Pink1會導(dǎo)致線粒體功能受損,而線粒體功能紊亂引起的神經(jīng)突觸退化、神經(jīng)元萎縮甚至凋亡在PD的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。因此,通過調(diào)節(jié)Pink1的表達(dá)來改善線粒體功能可能是一種有效對抗PD的神經(jīng)保護(hù)策略。然而Pink1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制及其在PD發(fā)生發(fā)展中的作用目前仍鮮有報道。MicroRNA(miRNA)是一類在細(xì)胞中高度保守并且不具有編碼蛋白質(zhì)功能的小分子單鏈RNA,其長度一般為20～25個核苷酸并廣泛存在于真核生物中,主要通過與靶基因mRNA的3'UTR(3'端非翻譯區(qū),3'untranslatedregion)互補配對從而發(fā)揮在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白表達(dá)的功能。據(jù)統(tǒng)計,人體內(nèi)超過三分之一可編碼蛋白質(zhì)的基因都受到miRNA的調(diào)控,并且已發(fā)現(xiàn)miRNA參與了細(xì)胞增殖和凋亡、激素的分泌、腫瘤形成以及神經(jīng)退行性疾病等生理病理過程。越來越多的研究表明,miRNA異常表達(dá)在PD的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,其可能成為PD早期診斷的一種生物標(biāo)志物,亦或許可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)來達(dá)到延緩PD病理進(jìn)程的目的。MiR-24-3p是miRNA家族中重要的一員,在哺乳動物的各種組織中廣泛表達(dá),主要參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡,且其在不同腫瘤細(xì)胞的生長過程中所展現(xiàn)的作用各不相同。有研究表明PD患者血漿中miR-24-3p的表達(dá)與正常人相比顯著升高,提示miR-24-3p可能與PD的發(fā)生發(fā)展相關(guān),然而目前還沒有關(guān)于miR-24-3p在PD中具體作用的報導(dǎo)。因此,本文首先證明了 miR-24-3p靶向調(diào)節(jié)Pink1的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,通過離體和在體實驗研究miR-24-3p/Pink1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對MPTP/MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷和凋亡的影響及其機制。離體研究結(jié)果表明,miR-24-3p mimic抑制Pink1的表達(dá)且加劇MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷,而miR-24-3p inhibitor顯著抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷和凋亡通路的激活;進(jìn)一步的研究闡明了miR-24-3p inhibitor通過促進(jìn)損傷線粒體清除、改善線粒體功能,發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機制。最后我們對miR-24-3p inihbitor的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了在體驗證:中腦立體定位注射miR-24-3p antagomir顯著減輕MPTP誘導(dǎo)的A53Ttg/tg小鼠黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元損傷并減少A53Ttg/tg小鼠中腦α-synuclein蛋白聚積,同時上調(diào)A53Ttg/tg小鼠中腦自噬水平。本課題揭示了 miR-24-3p在PD病理進(jìn)程中的作用并闡明其機制,為靶向miR-24-3p/Pink1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)展PD治療新策略提供了實驗依據(jù)。目的:研究miR-24-3p/Pink1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對PD模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響及機制。方法:(1)C57BL/6J小鼠制備MPTP亞急性PD模型后免疫印跡(Western Blot,WB)檢測中腦Pink1蛋白表達(dá)、實時熒光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測中腦miR-24-3p表達(dá),培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞并給予不同濃度(0、100、200、400 μM)的MPP+刺激,WB檢測細(xì)胞Pink1蛋白表達(dá)、RT-PCR檢測細(xì)胞miR-24-3p表達(dá);(2)使用10月齡經(jīng)CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建的全身性Pink1基因敲除(Pink1-1-)大鼠,通過免疫組織化學(xué)法對其黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽性細(xì)胞進(jìn)行定量分析;(3)通過生物信息學(xué)分析結(jié)合文獻(xiàn)報導(dǎo)推測可能靶向Pink1并參與PD病理進(jìn)程的miRNA,RT-PCR檢測它們在MPTP亞急性PD模型小鼠中腦組織內(nèi)的表達(dá),篩選出最有可能轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)Pink1 表達(dá)的 miRNA(miR-24-3p);構(gòu)建 miR-24-3p 模擬物(miR-24-3p mimic)和miR-24-3p 抑制劑(miR-24-3p inhibitor),轉(zhuǎn)染 SH-SY5Y 細(xì)胞,Western Blot 檢測Pink1蛋白表達(dá),構(gòu)建野生型與突變型Pink1 mRNA3'UTR質(zhì)粒,與miR-24-3p mimic共轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞,熒光素酶報告基因檢測熒光素酶活性;(4)SH-SY5Y 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-24-3p mimic/miR-24-3p inhibitor(100 nM),給予 MPP+刺激(400 μM)后檢測細(xì)胞活力及LDH釋放,Annexin-V和PI雙染法、Hoechst染色法檢測細(xì)胞凋亡、Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-9)表達(dá);(5)SH-SY5Y 細(xì)胞共轉(zhuǎn)入 GFP-LC3 質(zhì)粒與 miR-24-3p inhibitor(100 nM),并使用MitoTracker Deep Red標(biāo)記線粒體,免疫熒光觀察miR-24-3p inhibitor對SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬的影響,同時分離細(xì)胞線粒體和胞漿蛋白,WB檢測線粒體和胞漿Parkin的表達(dá);(6)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-24-3p inhibitor(100 nM),給予MPP+刺激(400 μM)后采用JC-1染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位,MitoSox檢測細(xì)胞線粒體ROS,給予自噬抑制劑3-MA后采用流式細(xì)胞儀檢測受損線粒體數(shù)量;(7)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Pink1(100nM)或給予自噬抑制劑3-MA,MPP+刺激(400 μM)后檢測細(xì)胞活力(CCK-8)、LDH釋放;(8)采用RT-PCR和WB檢測A53Ttg/tg小鼠中腦miR-24-3p和Pink1表達(dá),A53Ttg/tg小鼠中腦立體定位注射帶紅色熒光標(biāo)記的miR-24-3p antagomir后制備MPTP亞急性PD模型,對黑質(zhì)致密部焦油紫染色陽性及TH陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù);Western Blot檢測中腦凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-9 表達(dá)。(9)A53Ttg/tg小鼠中腦 SNc 區(qū)立體定位注射miR-24-3p antagomir后免疫熒光雙標(biāo)觀察TH和α-synuclein共定位情況。(10)A53Ttg/tg 小鼠中腦 SNc 區(qū)立體定位注射 miR-24-3p antagomir 后 Western Blot檢測自噬蛋白LC3和p62表達(dá);免疫熒光雙標(biāo)觀察TH和LC3共定位情況。結(jié)果:(1)MPTP亞急性PD模型小鼠中腦Pink1蛋白表達(dá)下調(diào)C57BL/6J小鼠制備MPTP亞急性PD模型后中腦Pink1蛋白表達(dá)顯著降低,200、400μM MPP+刺激SH-SY5Y細(xì)胞顯著下調(diào)Pink1蛋白水平。(2)Pik1基因敲除大鼠SNc區(qū)TH+神經(jīng)元數(shù)目顯著減少免疫組織化學(xué)法對10月齡Pink1基因敲除大鼠中腦黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示,基礎(chǔ)狀態(tài)下Pink1-/-大鼠與WT大鼠相比黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)減少了 43%。(3)MiR-24-3p靶向調(diào)節(jié)Pink1表達(dá)通過生物信息學(xué)網(wǎng)站(Targetscan,mirDIP,miRcode)預(yù)測結(jié)合文獻(xiàn)報導(dǎo)推測miR-24-3p、miR-29b、miR-30b和miR-142-5p可能參與PD病理進(jìn)程并靶向調(diào)節(jié)Pink1表達(dá);C57BL/6J小鼠制備MPTP亞急性PD模型后中腦miR-24-3p表達(dá)升高,miR-29b 表達(dá)下降,miR-30b 和 miR-142-5p 表達(dá)不變,MPP+(100、200、400 μM)刺激SH-SY5Y細(xì)胞呈濃度依賴性升高miR-24-3p水平,提示miR-24-3p可能靶向調(diào)節(jié)Pink1表達(dá);miR-24-3p mimic顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞Pink1蛋白表達(dá)(P0.01),而 miR-24-3p inhibitor 顯著上調(diào) Pink1 蛋白水平(P0.01);WT-Pink1 3'UTR質(zhì)粒與miR-24-3p mimic共轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞后熒光素酶活性顯著下降(P0.01),而突變型Mut-Pink1 3'UTR質(zhì)粒與miR-24-3pmimic共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性無明顯變化。(4)MiR-24-3p inhibitor減輕MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷及凋亡轉(zhuǎn)染 miR-24-3p inhibitor(100 nM,24 h)部分逆轉(zhuǎn) MPP+(400 μM)引起的SH-SY5Y細(xì)胞活力降低(P0.05)和LDH釋放增加(P0.05),并抑制MPP+引起的細(xì)胞核固縮和凋亡通路活化;MiR-24-3pmimic(100nM,24h)進(jìn)一步加劇MPP+所致細(xì)胞活力降低、LDH釋放增加以及細(xì)胞凋亡。Pink1干擾RNA(si-Pink1,100nM)能取消 miR-24-3p inhibitor 的細(xì)胞保護(hù)作用。(5)MiR-24-3p inhibitor促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬、改善線粒體功能轉(zhuǎn)染miR-24-3p inhibitor(100 nM,24 h)后SH-SY5Y細(xì)胞自噬小體與線粒體共定位顯著增多,胞漿Parkin蛋白水平顯著下降,線粒體Parkin表達(dá)增加,表明miR-24-3p inhibitor促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬;MPP+刺激(400 μM)顯著促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生、降低細(xì)胞線粒體膜電位、引起細(xì)胞線粒體損傷,下調(diào)miR-24-3p表達(dá)顯著抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體ROS增多(P0.01)、維持細(xì)胞正常線粒體膜電位(P0.01),并減少受損線粒體數(shù)量(P0.01);自噬抑制劑3-MA(5 mM)能取消miR-24-3p inhibitor對異常線粒體的清除作用及細(xì)胞保護(hù)作用(P0.05)。(6)MiR-24-3p antagomir減輕MPTP誘導(dǎo)的A53Ttg/tg小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元損傷A53Ttg/tg小鼠與WT小鼠相比中腦miR-24-3p水平顯著升高(p0.05)且Pink1表達(dá)降低(P0.01);中腦立體定位注射miR-24-3p antagomir(雙側(cè)注射,每側(cè)0.5 nmol,注射完成5天后進(jìn)行后續(xù)實驗)顯著減輕MPTP誘導(dǎo)的A53Ttg/tg小鼠SNc區(qū)焦油紫染色及TH免疫陽性細(xì)胞丟失、抑制MPTP引起的中腦神經(jīng)元凋亡,并減少A53Ttg/tg小鼠SNc區(qū)α-synuclein蛋白積聚。(7)MiR-24-3p antagomir上調(diào)A53Ttg/tg小鼠中腦自噬水平立體定位注射miR-24-3p antagomir顯著上調(diào)A53Ttg/tg小鼠中腦LC3-II蛋白表達(dá)、促進(jìn)p62降解;免疫熒光結(jié)果顯示,miR-24-3p antagomir顯著促進(jìn)LC3蛋白與TH共定位。表明miR-24-3p antagomir顯著提高A53Ttg/tg小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元自噬水平。結(jié)論:(1)MiR-24-3p轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)Pink1表達(dá)。(2)MiR-24-3p inhibitor通過促進(jìn)線粒體自噬、改善線粒體功能減輕MPTP/MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷。本工作的主要創(chuàng)新之處:(1)發(fā)現(xiàn)miR-24-3p靶向抑制Pink1表達(dá),從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的新角度闡釋了Pink1在MPTP/MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷中的重要作用。(2)闡明miR-24-3p inhibitor通過上調(diào)Pink1表達(dá)、促進(jìn)線粒體自噬保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的新機制,為干預(yù)miR-24-3p/Pink1/線粒體自噬通路發(fā)展PD治療新策略提供了直接的實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Detection of apoptosis induced by new type gosling viral enteritis virus in vitro through fluorescein annexin V-FITC/PI double labeling[J];World Journal of Gastroenterology;2008年14期

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本文編號：2656971