發(fā)布時間：2020-05-09 22:13

【摘要】：惡性腫瘤現(xiàn)已成為我國居民的主要死亡原因。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤難治、易復(fù)發(fā)的主要原因,其中腫瘤腦轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的最嚴(yán)重后果之一,一旦發(fā)生腦轉(zhuǎn)移,預(yù)后非常差,5年存活率極低。因此,研究腫瘤細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移機(jī)制對于我國癌癥病人來說具有重要意義。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的三種癌癥。本課題旨在應(yīng)用模式動物斑馬魚,建立用于腫瘤腦轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的活體模型,并進(jìn)一步探索腫瘤腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制以及腫瘤細(xì)胞外泌體在腫瘤腦轉(zhuǎn)移中的作用。研究結(jié)果總結(jié)如下:1.在血腦屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑馬魚胚胎心包腔部位注射帶有紅色熒光標(biāo)記的鼠源性黑素瘤細(xì)胞tfRFP-B16-F10,對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)行檢測和統(tǒng)計(jì):胚胎存活率、注射部位含有腫瘤細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目和各個部位包括頭部、軀干、尾部的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目,以及總體轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。同時我們選取移植后的幼魚進(jìn)行活體成像實(shí)驗(yàn),實(shí)時觀察腫瘤細(xì)胞突破血腦屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)進(jìn)入腦組織的過程,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞是通過不斷地變形穿過腦內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入腦實(shí)質(zhì),在腦內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接出現(xiàn)以后,腫瘤細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移率大大降低,而緊密連接正是血腦屏障實(shí)現(xiàn)其功能的主要一部分,因此,我們得出結(jié)論:血腦屏障在抑制腫瘤細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了重要作用,另外,通過對發(fā)生腦轉(zhuǎn)移2d后的斑馬魚幼魚進(jìn)行長時程轉(zhuǎn)盤共聚焦拍攝,我們發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞沿著血管壁擴(kuò)增延伸,細(xì)胞集群不斷擴(kuò)大,這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的腦轉(zhuǎn)移生長情況相符,而且通過本部分實(shí)驗(yàn),我們成功建立了研究腫瘤腦轉(zhuǎn)移的斑馬魚模型。2.在血腦屏障開始形成后即3dpf的斑馬魚幼魚心包腔部位注射3-D纖維軟膠培養(yǎng)富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性細(xì)胞和普通培養(yǎng)的tfRFP-B16-F10腫瘤細(xì)胞,分別統(tǒng)計(jì)注射不同培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的胚胎存活率、注射部位腫瘤細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目和各個部位包括頭部、軀干、尾部的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目,以及總體轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明3-D纖維軟膠培養(yǎng)的高致瘤性細(xì)胞無論是總體轉(zhuǎn)移率還是腦轉(zhuǎn)移率都要高于普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞。因此,高致瘤性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能更強(qiáng)。另外,我們利用熒光顯微鏡連續(xù)觀察同一條幼魚體內(nèi)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞,可以很明顯的觀察腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位的生長。3.外泌體是30-100um的囊泡結(jié)構(gòu),在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,然而對于其作用機(jī)制的了解還不全面,因此我們擬利用本課題所建立的腫瘤腦轉(zhuǎn)移斑馬魚模型研究外泌體促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。我們利用DiI熒光染料使體外提取的外泌體帶上紅色熒光,將DiI-exosomes注射進(jìn)2dpf的斑馬魚胚胎心包腔部位,利用轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡觀察外泌體與血腦屏障腦內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用,我們發(fā)現(xiàn)外泌體可以被綠色熒光標(biāo)記的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞吸收,并且紅色熒光與腦內(nèi)皮細(xì)胞的綠色熒光存在共定位長達(dá)4h甚至更長,結(jié)果說明外泌體與腦內(nèi)皮細(xì)胞間存在相互作用,而這種相互作用很可能對腫瘤細(xì)胞穿過血腦屏障具有重要影響。我們先后嘗試了5次tfRFP-B16-F10及其外泌體的共注射以及1次非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549及其外泌體的共注射,監(jiān)測腦轉(zhuǎn)移,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期有較大出入,我們需要探究新的建模方式來構(gòu)建斑馬魚模型研究外泌體對腫瘤細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的影響。
【圖文】：

斑馬魚腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建與應(yīng)用 血腦屏障的結(jié)構(gòu)概述一旦發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，就意味著病人的生命進(jìn)入了倒計(jì)時，大腦是人體，其內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到高度保護(hù)，血腦屏障就是其最重要的一層保護(hù)罩障的結(jié)構(gòu)和功能又是怎樣的呢？1904 年，德國科學(xué)家保羅·埃爾利希首次發(fā)現(xiàn)了血腦屏障的存在，隨通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)血腦屏障將大腦與周邊組分嚴(yán)格的分割開來，控制著間的物質(zhì)交換，除非是脂溶性分子，否則很難通過血腦屏障。血腦理性的分隔作用，還具有信息傳遞的功能，，無論是血液循環(huán)系統(tǒng)

12圖 1-3：斑馬魚心血管發(fā)育過程Fig 1-3: The cardiac development in zebrafish圖 1-3. 從左往右依次為 2dpf 的斑馬魚胚胎，3-4dpf 的斑馬魚幼魚，右下為同一時期斑馬魚尾靜脈示意圖，右上為 5dpf 的斑馬魚幼魚（Kimmel CB et al 1995）.Fig 1-3. From left to right, images show 2dpf zebrafish embryo, 3-4 dpf zebrafish larva, caudal vein (low right)and 5 dpf zebrafish larva (upper right) (Kimmel et al 1995).
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41;R-332

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本文編號：2656820