【摘要】：惡性腫瘤現(xiàn)已成為我國居民的主要死亡原因。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤難治、易復發(fā)的主要原因,其中腫瘤腦轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的最嚴重后果之一,一旦發(fā)生腦轉(zhuǎn)移,預后非常差,5年存活率極低。因此,研究腫瘤細胞腦轉(zhuǎn)移機制對于我國癌癥病人來說具有重要意義。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的三種癌癥。本課題旨在應用模式動物斑馬魚,建立用于腫瘤腦轉(zhuǎn)移機制研究的活體模型,并進一步探索腫瘤腦轉(zhuǎn)移的分子機制以及腫瘤細胞外泌體在腫瘤腦轉(zhuǎn)移中的作用。研究結(jié)果總結(jié)如下:1.在血腦屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑馬魚胚胎心包腔部位注射帶有紅色熒光標記的鼠源性黑素瘤細胞tfRFP-B16-F10,對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移進行檢測和統(tǒng)計:胚胎存活率、注射部位含有腫瘤細胞團的數(shù)目和各個部位包括頭部、軀干、尾部的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目,以及總體轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。同時我們選取移植后的幼魚進行活體成像實驗,實時觀察腫瘤細胞突破血腦屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)進入腦組織的過程,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞是通過不斷地變形穿過腦內(nèi)皮細胞間隙進入腦實質(zhì),在腦內(nèi)皮細胞間緊密連接出現(xiàn)以后,腫瘤細胞的腦轉(zhuǎn)移率大大降低,而緊密連接正是血腦屏障實現(xiàn)其功能的主要一部分,因此,我們得出結(jié)論:血腦屏障在抑制腫瘤細胞腦轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了重要作用,另外,通過對發(fā)生腦轉(zhuǎn)移2d后的斑馬魚幼魚進行長時程轉(zhuǎn)盤共聚焦拍攝,我們發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞沿著血管壁擴增延伸,細胞集群不斷擴大,這與之前文獻報道的腦轉(zhuǎn)移生長情況相符,而且通過本部分實驗,我們成功建立了研究腫瘤腦轉(zhuǎn)移的斑馬魚模型。2.在血腦屏障開始形成后即3dpf的斑馬魚幼魚心包腔部位注射3-D纖維軟膠培養(yǎng)富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性細胞和普通培養(yǎng)的tfRFP-B16-F10腫瘤細胞,分別統(tǒng)計注射不同培養(yǎng)腫瘤細胞的胚胎存活率、注射部位腫瘤細胞團的數(shù)目和各個部位包括頭部、軀干、尾部的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目,以及總體轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果表明3-D纖維軟膠培養(yǎng)的高致瘤性細胞無論是總體轉(zhuǎn)移率還是腦轉(zhuǎn)移率都要高于普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的腫瘤細胞。因此,高致瘤性細胞的轉(zhuǎn)移潛能更強。另外,我們利用熒光顯微鏡連續(xù)觀察同一條幼魚體內(nèi)轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞,可以很明顯的觀察腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移部位的生長。3.外泌體是30-100um的囊泡結(jié)構(gòu),在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,然而對于其作用機制的了解還不全面,因此我們擬利用本課題所建立的腫瘤腦轉(zhuǎn)移斑馬魚模型研究外泌體促進腦轉(zhuǎn)移的分子機制。我們利用DiI熒光染料使體外提取的外泌體帶上紅色熒光,將DiI-exosomes注射進2dpf的斑馬魚胚胎心包腔部位,利用轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡觀察外泌體與血腦屏障腦內(nèi)皮細胞間的相互作用,我們發(fā)現(xiàn)外泌體可以被綠色熒光標記的腦微血管內(nèi)皮細胞吸收,并且紅色熒光與腦內(nèi)皮細胞的綠色熒光存在共定位長達4h甚至更長,結(jié)果說明外泌體與腦內(nèi)皮細胞間存在相互作用,而這種相互作用很可能對腫瘤細胞穿過血腦屏障具有重要影響。我們先后嘗試了5次tfRFP-B16-F10及其外泌體的共注射以及1次非小細胞肺癌細胞A549及其外泌體的共注射,監(jiān)測腦轉(zhuǎn)移,并進行統(tǒng)計分析,然而實驗結(jié)果與預期有較大出入,我們需要探究新的建模方式來構(gòu)建斑馬魚模型研究外泌體對腫瘤細胞腦轉(zhuǎn)移的影響。
【圖文】：

斑馬魚腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建與應用 血腦屏障的結(jié)構(gòu)概述一旦發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，就意味著病人的生命進入了倒計時，大腦是人體，其內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到高度保護，血腦屏障就是其最重要的一層保護罩障的結(jié)構(gòu)和功能又是怎樣的呢？1904 年，德國科學家保羅·埃爾利希首次發(fā)現(xiàn)了血腦屏障的存在，隨通過實驗證實血腦屏障將大腦與周邊組分嚴格的分割開來，控制著間的物質(zhì)交換，除非是脂溶性分子，否則很難通過血腦屏障。血腦理性的分隔作用，還具有信息傳遞的功能，，無論是血液循環(huán)系統(tǒng)

12圖 1-3：斑馬魚心血管發(fā)育過程Fig 1-3: The cardiac development in zebrafish圖 1-3. 從左往右依次為 2dpf 的斑馬魚胚胎，3-4dpf 的斑馬魚幼魚，右下為同一時期斑馬魚尾靜脈示意圖，右上為 5dpf 的斑馬魚幼魚（Kimmel CB et al 1995）.Fig 1-3. From left to right, images show 2dpf zebrafish embryo, 3-4 dpf zebrafish larva, caudal vein (low right)and 5 dpf zebrafish larva (upper right) (Kimmel et al 1995).
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41;R-332

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本文編號：2656820