【摘要】：結(jié)膜吸吮線蟲,可寄生于家畜、野生食肉動物及人的結(jié)膜囊內(nèi),導(dǎo)致結(jié)膜吸吮線蟲病,主要表現(xiàn)為結(jié)膜炎,結(jié)膜充血,淚腺分泌物增加,嚴(yán)重者可出現(xiàn)角膜潰瘍,甚至失明。1910年在印度犬的結(jié)膜囊內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)結(jié)膜吸吮線蟲,1917年在我國的北京和福州首次發(fā)現(xiàn)人感染病例。目前,世界多地均有結(jié)膜吸吮線蟲病的報道,但大多數(shù)病例出現(xiàn)在亞洲的東部和東南部地區(qū),因此結(jié)膜吸吮線蟲又稱為東方眼蟲。我國是結(jié)膜吸吮線蟲感染病例最多的國家,已有超過600例病例報道。近年來,結(jié)膜吸吮線蟲病發(fā)病數(shù)在我國部分地區(qū)呈上升趨勢,已經(jīng)成為新現(xiàn)的動物源性寄生蟲病。盡管我國多地存在結(jié)膜吸吮線蟲病的威脅,但有關(guān)結(jié)膜吸吮線蟲的系統(tǒng)性鑒定及遺傳多態(tài)性研究仍比較薄弱,本研究首先對我國3例結(jié)膜吸吮線蟲臨床分離株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,并對其線粒體基因組進(jìn)行重測序,然后對我國11個地區(qū)的蟲體分離株進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析,為結(jié)膜吸吮線蟲病的預(yù)防及控制策略奠定基礎(chǔ)。材料與方法1結(jié)膜吸吮線蟲的鑒定:分別使用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對我國中部地區(qū)的三條結(jié)膜吸吮線蟲臨床分離株進(jìn)行觀察,并對關(guān)鍵形態(tài)部位進(jìn)行拍照、描述和記錄,根據(jù)分類檢索表,對其進(jìn)行物種鑒定。2線粒體基因組的測序及組裝:使用長PCR擴(kuò)增法對結(jié)膜吸吮線蟲的線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增,在Illumina HiSeq 2000平臺上進(jìn)行高通量測序。然后使用FastQC v.0.11.5軟件對原始的測序讀長進(jìn)行質(zhì)量評價,接著使用CLC Genomic Workbench v.7.0.4軟件將這些修飾過的序列標(biāo)注到結(jié)膜吸吮線蟲兩個參考線粒體組(NC_018363和AP017700)序列上。最后,使用MITOS對線粒體基因進(jìn)行注釋,并提交至GenBnak數(shù)據(jù)庫。3結(jié)膜吸吮線蟲種群的遺傳多態(tài)性分析:選用五個分子標(biāo)記:cytb、cox1、12S rDNA、ITS1和18S rDNA對結(jié)膜吸吮線蟲的遺傳多樣性進(jìn)行分析。使用DnaSP v5.10軟件估算每個分子標(biāo)記的單倍型數(shù)量、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)。單倍型之間的中介連接網(wǎng)絡(luò)關(guān)系使用Network v5.0軟件進(jìn)行繪制。種群之間的遺傳差異性水平用F_(ST)值進(jìn)行評估。使用Arlequin程序中的岐點分布分析來估計結(jié)膜吸吮線蟲種群結(jié)構(gòu)變化。同樣使用Arlequin程序中的Tajima’s D檢驗和Fu’s F_S檢驗推斷種群是否發(fā)生過種群擴(kuò)張。此外,基于cox1序列比較全球不同地區(qū)不同宿主結(jié)膜吸吮線蟲分離株間的遺傳差異。4系統(tǒng)發(fā)育分析:分別用最大簡約法(MP)和貝葉斯法(BI)進(jìn)行結(jié)膜吸吮線蟲cox1單倍型的系統(tǒng)發(fā)育模式分析。MP分析在PAUP*4b10中進(jìn)行,BI分析在MrBayes v3.2中進(jìn)行。結(jié)果1結(jié)膜吸吮線蟲形態(tài)特征:觀察到雌蟲的主要特征有:結(jié)膜吸吮線蟲特有的口囊特征;在蟲體后半部,子宮內(nèi)中充滿未成熟的卵和生殖細(xì)胞;蟲體前部橫向條紋的角質(zhì)層比尾端更明顯;包含短瓣結(jié)構(gòu)的陰門位于蟲體的前部。雄蟲的主要特征有:和雌蟲相比,雄蟲的口囊不明顯,口腔張開時呈圓形或橢圓形,雄蟲有兩個不同的交合刺,左邊的較長,右邊較短呈典型的月牙型,蟲體尾端彎曲,雄蟲尾部有5對乳狀突起。2結(jié)膜吸吮線蟲線粒體組的特征及比較:結(jié)膜吸吮線蟲線粒體基因組具有12個PCGs、22個tRNA基因和2個rRNA基因。所有基因的排列順序及蛋白基因編碼方向與長度均相同。在線粒體基因中,一些基因存在重疊區(qū)域。22個tRNA基因長度范圍在53到66個堿基之間。在cox3和丙氨酸(trnA)基因之間,存在一段較長(316 bp)的非編碼區(qū)。來自不同地區(qū)的結(jié)膜吸吮線蟲線粒體基因組序列的相似性為98.22%。蛋白編碼基因序列之間相似性最高的是nad4L,最低的是atp6。氨基酸序列相似性最高的為cox1,最低的是nad6。線粒體核糖體大小亞基rDNA的序列相似性分別為89.95%和96.71%。3結(jié)膜吸吮線蟲分離株的多態(tài)性及遺傳差異比較:我國11個地區(qū)的32個結(jié)膜吸吮線蟲臨床分離株中具有較高的遺傳多態(tài)性。全球不同地區(qū)的cox1基因共鑒定出21個單倍型,歐洲國家的結(jié)膜吸吮線蟲均為Hap1,結(jié)膜吸吮線蟲Haps2 8和haps10 12主要存在于犬分離株中。Hap9和haps13 21主要存在于臨床分離株中。21個單倍型的比對發(fā)現(xiàn)37處核苷酸變異。種群差異性分析結(jié)果顯示,歐洲和亞洲國家種群的差別大于中國,韓國,日本種群間的差別。中性檢測及岐點分布分析結(jié)果均不支持結(jié)膜吸吮線蟲種群存在擴(kuò)張效應(yīng)。4系統(tǒng)發(fā)育重建:在旋尾目線蟲中,顎體科與龍線科+嗜子宮科+泡翼科+吸吮科+筒線科+絲狀科+盤尾絲蟲科組成的分枝是姊妹類群。在較大的分枝中,最早分化出來的是龍線蟲科和嗜子宮科。盤尾絲蟲科作為一個單系分支,是最晚分化出來的。來自歐洲和亞洲國家的結(jié)膜吸吮線蟲種群被分成兩個亞群,這兩個種群在更新世中期開始分化。結(jié)論1基于光鏡和電鏡的形態(tài)特征,所有的臨床分離株均被鑒定為結(jié)膜吸吮線蟲。2在結(jié)膜吸吮線蟲線粒體基因中,nad6基因顯示出較高的序列變異,可作為結(jié)膜吸吮線蟲種群遺傳學(xué)研究的靶基因。3在cox1序列中有5個核苷酸位點可以將結(jié)膜吸吮線蟲歐洲和亞洲分離株進(jìn)行區(qū)分。歐洲和亞洲種群的遺傳差異要大于中國,韓國,日本等亞洲國家種群之間的差別。4歐洲和亞洲的結(jié)膜吸吮線蟲種群可以分為兩個亞群,且這兩個亞群在更新世中期開始分化。5系統(tǒng)發(fā)育分析顯示吸吮科、盤尾絲蟲科、絲狀科、筒線科、泡翼科、龍線科和嗜子宮科的親緣關(guān)系較近。
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圖 4.1 結(jié)膜吸吮線蟲蟲體局部特征注釋：Fa：雌蟲口囊；Fb：子宮后半段未成熟卵或生殖細(xì)胞；Fc 和 Fd：尾感器和肛Fe：表皮角質(zhì)層；Ff：雌蟲陰門；Ma：雄蟲口囊；Mc:雄蟲交合刺；Md：雄蟲圓形圓形的口囊；Me：雄蟲交合刺；Mf：雄蟲尾端五對尾感器。4.3 線粒體組的特征及比較結(jié)膜吸吮線蟲分離株HeN-LY1，HeN-PDS1和HeN-ZZ1分別有961 424，961 094和104個序列讀長及162 140 093，166 174 524和162 301 339個堿基被回帖到線粒體基上，詳細(xì)信息見表4.1。表 4.1 Illumina 測序結(jié)膜吸吮線蟲線粒體基因組的組裝和序列統(tǒng)計樣本線粒體基因長度(bp)序列 長度*(bp) 堿基 Q20(%) GC(%)N#(ppm)HeN-LY1 13668 961424 168.65 162140093 97.41 26.41 19.03HeN-PDS1 13667 961094 172.90 166174524 97.63 26.97 16.01HeN-ZZ1 13668 970104 168.72 162301339 97.69 25.36 18.59*讀取的平均長度；#每百萬分之一堿基；Q20 表示誤差概率為 1%。分別對三個新的線粒體基因組序列進(jìn)行了注釋，每個線粒體基因組都具有PCGs、22個tRNA基因和2個rRNA基因。所有基因的排列順序及編碼方向均相同，

分別對三個新的線粒體基因組序列進(jìn)行了注釋，每個線粒體基因組都具有12個PCGs、22個tRNA基因和2個rRNA基因。所有基因的排列順序及編碼方向均相同，并且HeN-LY1，HeN-PDS1和HeN-ZZ1三個線粒體組的蛋白編碼基因的長度均相同(圖4.2 )。圖 4.2 結(jié)膜吸吮線蟲線粒體基因注釋在線粒體基因中，，一些基因存在重疊區(qū)域，如：nad6/trnR，有9 bp序列重合，rnL1/cox3(3 bp)，trnL2/trnN (11 bp)，nad1/trnF (32 bp)，cox2/trnH (10 bp)，rrnL/nad3 (8 bp)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R383.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 王增賢;沈繼龍;杜繼雙;江寶玲;韓錫鵬;王志成;;換代犬與阻斷結(jié)膜吸吮線蟲病流行關(guān)系的研究[J];熱帶病與寄生蟲學(xué);2003年04期

2 王增賢,陳群,江寶玲,王志成,沈繼龍;中國結(jié)膜吸吮線蟲及結(jié)膜吸吮線蟲病流行病學(xué)[J];疾病控制雜志;2002年04期

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