【摘要】：目的:自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cell,NK細(xì)胞)作為一種固有免疫細(xì)胞,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。目前關(guān)于NK細(xì)胞的研究主要集中于NK細(xì)胞表面受體以及相關(guān)信號(hào)通路對(duì)其發(fā)育和功能的影響等方面,我們研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞在發(fā)揮功能時(shí),會(huì)伴隨著染色質(zhì)及其組蛋白修飾狀態(tài)的變化,而組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a在組蛋白修飾中具有重要的作用,并且組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對(duì)造血干細(xì)胞以及T細(xì)胞發(fā)育有著重要的影響,另外組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a是否會(huì)影響NK細(xì)胞的發(fā)育及其功能尚未報(bào)道,因此探討組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a在NK細(xì)胞的作用具有重要意義,本研究主要從表觀遺傳學(xué)的角度探討G9a如何影響NK細(xì)胞的功能及其作用機(jī)制。方法:第一部分:從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中分析相關(guān)數(shù)據(jù),在NK細(xì)胞免疫信號(hào)通路被激活的情況下,尋找表達(dá)水平變化最顯著的組蛋白甲基化酶和去甲基化酶,發(fā)現(xiàn)G9a在NK細(xì)胞激活之后顯著下調(diào),并用qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證G9a的變化。從外周血中分選獲得原代NK細(xì)胞,加入抑制G9a酶活性的小分子抑制劑,采用western blot方法檢測(cè)加入小分子抑制劑后,G9a修飾的NK細(xì)胞中IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域H3K9me2的修飾水平;并用流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞在被激活的情況下,抑制G9a的酶活性后IFN-γ的表達(dá)變化。第二部分:采用qPCR在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)不同條件激活的NK細(xì)胞系的IFN-γ的表達(dá)變化,并用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等技術(shù)檢測(cè)IFN-γ在蛋白水平的表達(dá)變化;ChIP-qPCR檢測(cè)在抑制G9a酶活性前后,NK細(xì)胞系中IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域H3K9me2的修飾水平變化。結(jié)果:第一部分:高通量分析結(jié)果顯示,NK細(xì)胞在被激活的情況下,G9a的表達(dá)量下調(diào);在抑制NK細(xì)胞中G9a甲基轉(zhuǎn)移酶活性后,可以增強(qiáng)NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。第二部分:通過在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平兩個(gè)層次上的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),抑制NK細(xì)胞G9a甲基轉(zhuǎn)移酶活性后,NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力增強(qiáng);ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在抑制G9a的酶活性后,IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域基因的H3K9me2修飾水平明顯下降。結(jié)論:1.G9a可以調(diào)控NK細(xì)胞的激活。抑制G9a酶活性后,可以顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性。2.G9a通過調(diào)控IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域H3K9me2的修飾水平來調(diào)控其表達(dá),抑制G9a酶活性可以增強(qiáng)NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。
【圖文】：

19圖 1.1 NK 細(xì)胞在被細(xì)胞因子激活后 G9a/EHMT2 的表達(dá)(A) GO 富集分析激活型的 NK 細(xì)胞在功能上的特點(diǎn)。(B)基因芯片分子刺激24h后的NK細(xì)胞用相對(duì)于本底狀態(tài)NK細(xì)胞組蛋白甲基化酶酶的變化。(C) RT-PCR 檢測(cè) G9a 基因的表達(dá)，，在 NK 細(xì)胞用細(xì)胞因子和 IL-18）刺激 24h 后組蛋白甲基化酶 G9a/EHMT2 表達(dá)下調(diào)。*：p＜0.01；***：p＜0.001。1.2.2 檢測(cè)抑制原代外周血 NK 細(xì)胞中甲基化酶活性的效果根據(jù)基因芯片的表達(dá)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn) G9a 這個(gè)組蛋白甲基化酶

學(xué)碩士學(xué)位論文 一、G9a 狀態(tài)的改變對(duì)激活 NK 細(xì)且在 mRNA 水平也驗(yàn)證了這一結(jié)果。緊接著我們根據(jù)9me2 對(duì)淋巴細(xì)胞的發(fā)育以及功能都有影響，但是對(duì) 。所以根據(jù)先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)是否抑制了 G9a 的酶能有提高作用？因此，我們從外周血中分選出 NK 細(xì)-01294，以 DMSO 為對(duì)照組，通過 western blot 實(shí)驗(yàn)檢-01294 后對(duì) NK 細(xì)胞的 H3K9me2 表達(dá)的影響（圖 1，和 DMSO 處理的 control 組相比，NK 細(xì)胞在不同濃理后，總 H3K9me2 甲基化水平明顯下降，表明小分子明顯的抑制，而 2 μM 濃度的 BIX-01294 抑制效果最為用 2μM 濃度的 BIX-01294 處理 NK 細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392.12

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本文編號(hào)：2656351