發(fā)布時(shí)間：2020-05-08 19:22

【摘要】：細(xì)胞核酸結(jié)合蛋白(CNBP)也稱鋅指蛋白9(ZNF9),其在脊椎動(dòng)物中高度保守,以特定的序列方式結(jié)合DNA或RNA。它含有七個(gè)串聯(lián)鋅指重復(fù)序列,由Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys的14個(gè)相同氨基酸組成。到目前為止,已經(jīng)從人類、小鼠、大鼠、雞、非洲爪蟾、蟾蜍、斑馬魚和銀鯽中克隆了CNBP的cDNA。在低等脊椎動(dòng)物中的研究數(shù)據(jù)表明,CNBP在睪丸中高度表達(dá)。然而,CNBP在哺乳動(dòng)物睪丸中的定位和功能尚不明確。為了全面了解CNBP在哺乳動(dòng)物睪丸中的定位與功能機(jī)制,我們利用課題組已有的精原干細(xì)胞(SSCs)體外培養(yǎng)平臺(tái)與生精小管體外培養(yǎng)平臺(tái)研究了抑制CNBP表達(dá)后對(duì)新生小鼠睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的影響。首先運(yùn)用qRT-PCR與Western Blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)在0天和7天小鼠睪丸中CNBP表達(dá)較高,從14天開始顯著下降,并且在成年小鼠睪丸中CNBP表達(dá)非常低。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CNBP定位于小鼠睪丸早期的生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞。此結(jié)果提示CNBP是新生小鼠睪丸發(fā)育所必需的。進(jìn)一步我們?cè)隗w外培養(yǎng)的小鼠睪丸組織和精原干細(xì)胞(SSCs)中使用Morpholino對(duì)CNBP進(jìn)行抑制表達(dá)。HE染色和免疫熒光染色結(jié)果顯示CNBP表達(dá)下降后,生精小管基膜結(jié)構(gòu)紊亂,支持細(xì)胞定位錯(cuò)亂,生殖細(xì)胞凋亡以及間質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增。此外,在該研究中觀察到抑制CNBP表達(dá)后引起小鼠睪丸中的WNT/β-catenin通路異�；罨�,而使用該通路的抑制劑XAV939進(jìn)行干預(yù)可以對(duì)已有的表型進(jìn)行挽救。為了觀察CNBP抑制后引起的生殖細(xì)胞凋亡是直接效應(yīng)還是間接效應(yīng),我們?cè)隗w外培養(yǎng)的SSCs中使用Morpholino對(duì)CNBP進(jìn)行抑制表達(dá),結(jié)果顯示SSCs正常生長(zhǎng)。綜上所述,CNBP通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的Wnt/β-catenin通路來維持小鼠睪丸發(fā)育和精子發(fā)生。
【圖文】：

不同時(shí)間點(diǎn)小鼠睪丸中Cnbp的mRNA表達(dá)水平

我們使用 qRT-PCR 檢測(cè)小鼠不同時(shí)間點(diǎn)睪丸 Cnbp 的 mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示在 0 天和 7 天睪丸中 Cnbp 表達(dá)較高，從 14 天開始顯著下降，，并且在成年小鼠睪丸中 Cnbp 表達(dá)非常低（圖 1）。之后我們通過 Western Blot進(jìn)行蛋白水平的表達(dá)檢測(cè)，其結(jié)果與mRNA表達(dá)模式是 致的（圖2A和B）。圖 1 不同時(shí)間點(diǎn)小鼠睪丸中 Cnbp 的 mRNA 表達(dá)水平。以 0 d 表達(dá)水平為參照，各時(shí)間點(diǎn)與之比較，0-7 d Cnbp 處于高表達(dá)水平，從 14 d 開始顯著下降，至成年幾乎不表達(dá)（*** p<0.001）。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R339.21

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本文編號(hào)：2655040