【摘要】：下丘腦(Hypothalamus,HP)作為間腦的主要組成部分,是一個高度異質(zhì)性的區(qū)域,其由不同的核團(tuán)組成,可以接收大量內(nèi)外感覺信息,發(fā)揮著非常重要的生理功能,如參與本能行為,睡眠-覺醒周期和攝食行為的調(diào)控。功能依賴于細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的協(xié)調(diào)輸出,同時環(huán)路的異質(zhì)性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、行為狀態(tài)的多樣性會導(dǎo)致功能的差異,其中細(xì)胞類型的多樣性更是構(gòu)成環(huán)路的最基礎(chǔ)元素。構(gòu)成HP區(qū)域細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要神經(jīng)元有食欲素(orexin/hypocretin)神經(jīng)元、黑素濃集激素(melanin-concentrating hormone,MCH)神經(jīng)元、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)神經(jīng)元和谷氨酸能(Glutamatergic,Glut)神經(jīng)元等。這些神經(jīng)元共同分布在外側(cè)下丘腦區(qū)(lateral hypothalamus area,LHA)、穹隆周區(qū)(perifornical area,PeF)、未定帶(zona incerta,ZI)、背內(nèi)側(cè)下丘腦(dorsomedial hypothalamus,DMH)等區(qū)域,有著緊密的相互聯(lián)系,共同維持HP的穩(wěn)態(tài)功能。我們重點關(guān)注HP以orexin神經(jīng)元為主的細(xì)胞分布,因此,我們將全部orexin神經(jīng)元在HP分布的立體范圍,定義為HP-orexin區(qū),主要探究該區(qū)域內(nèi)的主要神經(jīng)元分布模式。在二維空間上已有研究對orexin和MCH兩種神經(jīng)元的整體分布進(jìn)行過描述和統(tǒng)計,但是對整體及各亞腦區(qū)的具體三維分布模式及形態(tài)學(xué)特征尚缺乏直接有力的證據(jù),向外投射的orexin神經(jīng)元群組如何分布也尚未知曉,且關(guān)于GABA與Glut神經(jīng)元在HP-orexin區(qū)內(nèi)的共同分布模式也尚不清楚。在orexin和MCH的發(fā)育表達(dá)相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),大鼠orexin mRNA和蛋白質(zhì)在胚胎發(fā)育第12天(embryonic 12,E12)即可檢測到,而MCH mRNA和蛋白質(zhì)在E16才能檢測到;小鼠的orexin神經(jīng)元胚胎發(fā)育與大鼠基本相一致,而MCH神經(jīng)元在大鼠和小鼠中的分布位置和發(fā)育情況則有所差異:在大鼠中,MCH神經(jīng)元發(fā)生的峰值與orexin神經(jīng)元發(fā)生的峰值相比略晚;在小鼠中,MCH和orexin神經(jīng)元發(fā)生的峰值相一致。但是以小鼠為研究對象,針對出生后orexin與MCH神經(jīng)元發(fā)育是否同步,在發(fā)育至成年的過程中神經(jīng)元有沒有發(fā)生亞群的遷移以及數(shù)量的增多或減少,與成年數(shù)量、大小、分布范圍在何時達(dá)到一致等問題仍沒有詳細(xì)確切的結(jié)論。因此,本研究擬采用免疫熒光、連續(xù)成像、三維重建和形態(tài)特征測量的方法重構(gòu)orexin與MCH神經(jīng)元的整體和亞腦區(qū)三維結(jié)構(gòu),同時探究各組分布特點和形態(tài)特征,及與GABA、Glut能神經(jīng)元之間的相互位置關(guān)系;隨后對orexin和MCH神經(jīng)元不同發(fā)育階段的三維分布模式和形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行詳細(xì)探究。主要結(jié)果有:1.成年orexin與MCH神經(jīng)元在HP整體和不同亞腦區(qū)具有不同三維分布模式為了詳細(xì)分析HP-orexin區(qū)的兩種神經(jīng)元分布模式,我們依照小鼠Allen腦圖譜進(jìn)行比對,將orexin和MCH神經(jīng)元還原到圖譜腦區(qū)中,進(jìn)行不同亞腦區(qū)的神經(jīng)元三維重建,并對數(shù)量、神經(jīng)元大小、徑向分布距離等形態(tài)特征進(jìn)行測量統(tǒng)計。結(jié)果顯示:成年orexin神經(jīng)元主要分布在LHA,形成一個立體的中心區(qū)域,MCH神經(jīng)元以包繞模式分布在orexin神經(jīng)元的周圍,核心部分僅有少量與orexin神經(jīng)元混雜。成年小鼠的單側(cè)orexin神經(jīng)元數(shù)量為2212±144個,MCH神經(jīng)元數(shù)量為3032±82個,MCH神經(jīng)元在單側(cè)腦區(qū)的數(shù)量上大概是orexin神經(jīng)元的1.3倍。Orexin神經(jīng)元在背-腹(dorsal ventral,D-V)軸的分布距離要廣于MCH神經(jīng)元,但在喙尾(rostra caudal,R-C)軸和內(nèi)外(medial lateral,M-L)軸的范圍則小于MCH神經(jīng)元。Orexin和MCH神經(jīng)元均主要分布在LHA、ZI、DMH、后下丘腦(posterior hypothalamus,PH)、前旁丘腦底核(preparasubthalamus,PST)、旁丘腦底核(parasubthalamus,PSTN)六個亞腦區(qū),但兩種神經(jīng)元在這些不同的亞腦區(qū)中分布模式和數(shù)量均有差異(n=3,P0.05)。其中LHA的兩種神經(jīng)元數(shù)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他亞腦區(qū),且orexin神經(jīng)元數(shù)量更多;PSTN區(qū)的兩種神經(jīng)元數(shù)量分布則比較均衡,而ZI、DMH、PH區(qū),皆以MCH神經(jīng)元為主。2.成年orexin、MCH和GABA神經(jīng)元沿R-C軸呈現(xiàn)不同的分布模式Orexin和MCH兩種神經(jīng)元在每個亞腦區(qū)的R-C軸總數(shù)量差別明顯,為了更加精細(xì)的獲得R-C軸不同層面的神經(jīng)元數(shù)量分布,我們將R-C軸從喙側(cè)向尾側(cè)進(jìn)行分割,約120μm作為1個單位條帶(S),共9個。在不同的亞腦區(qū)內(nèi),兩種神經(jīng)元數(shù)量分布的總趨勢從S1到S9都是先增多再減少。GABA神經(jīng)元主要分布在orexin和MCH神經(jīng)元間隙及周圍,在R-C軸方向從R端到C端變化的過程中,中心位置之前表現(xiàn)為orexin神經(jīng)元比例增加,MCH和GABA神經(jīng)元比例下降,主要以GABA神經(jīng)元下降為主;中心位置之后則表現(xiàn)為orexin神經(jīng)元比例減少,而MCH神經(jīng)元和GABA神經(jīng)元的比例則增加,主要以MCH神經(jīng)元的增加為主。同時每個亞腦區(qū)也有各自的分布特點,大部分亞腦區(qū)的orexin神經(jīng)元數(shù)量高峰層出現(xiàn)在MCH神經(jīng)元的喙側(cè)。另外三種神經(jīng)元相對細(xì)胞密度變化也不同:GABA神經(jīng)元相對細(xì)胞密度沒有差異(n=3,P0.05),orexin神經(jīng)元相對細(xì)胞密度則由高密度變?yōu)榈兔芏?而MCH反之。3.投射到丘腦室旁核(paraventricular thalamus,PVT)的orexin神經(jīng)元沿R-C軸呈現(xiàn)先增多后減少的分布模式為了明確orexin神經(jīng)元向PVT的單級輸出,我們利用Vglut-2-cre小鼠在PVT注射AAV-DIO-TVA-EGFP和AAV-DIO-RVG混合液,3周后注射逆行追蹤病毒-狂犬病毒(rabies virus,RV),形成起始細(xì)胞后進(jìn)行單級突觸逆行追蹤,可以直接觀察靶向PVT的orexin神經(jīng)元的分布。結(jié)果顯示,RV逆行標(biāo)記與orexin共標(biāo)的神經(jīng)元都位于LHA,并由喙側(cè)向尾側(cè)呈現(xiàn)先增多再減少的分布規(guī)律。其中,在共標(biāo)神經(jīng)元存在的層面中,在orexin神經(jīng)元分布的偏中心位置(bregma-1.70mm)共標(biāo)的神經(jīng)元最多,約12個,而單側(cè)共標(biāo)的orexin神經(jīng)元數(shù)量占單側(cè)總體orexin數(shù)量的12%左右(n=3)。4.Orexin和MCH神經(jīng)元在發(fā)育不同時期神經(jīng)元大小變化從個體角度對神經(jīng)元的大小進(jìn)行分析,利用免疫熒光技術(shù)雙重標(biāo)記orexin和MCH神經(jīng)元,在同樣的放大倍數(shù)下,可以清晰的看到神經(jīng)元大小的改變。用橫斷面長徑(transection major axis,TMaA)和橫斷面短徑(transection minor axis,TMiA)作為衡量神經(jīng)元大小的指標(biāo),結(jié)果顯示:相比出生后1天(postnatal 1,P1),orexin和MCH神經(jīng)元的TMaA和TMiA均在P7發(fā)生了明顯增大(n=3,P0.05),而P14并沒有與P7的大小顯現(xiàn)出差別(n=3,P0.05)。兩種神經(jīng)元的TMaA和TMiA在P21時,達(dá)到了成年神經(jīng)元大小的水平,但P14和P21在神經(jīng)元橫斷面長度上仍有差異(n=3,P0.05)。5.Orexin和MCH神經(jīng)元在發(fā)育不同時期徑向距離變化從徑向距離的長度進(jìn)行下一步分析:orexin神經(jīng)元的M-L軸和D-V軸長度逐漸增加至P14,然而MCH神經(jīng)元僅在P7和P21時顯示出R-C軸的增加。但兩種神經(jīng)元的R-C軸并沒有在P21時達(dá)到成年的穩(wěn)定狀態(tài)。另外,orexin神經(jīng)元在D-V軸上的生長速度比M-L軸和R-C軸更快,而MCH神經(jīng)元在M-L軸上的生長速度則快于其他兩個軸。兩種神經(jīng)元之間的比較則更加有規(guī)律,從P1到成年(P56),二者在D-V軸長度上表現(xiàn)出明顯的差異(n=3,P0.05)。6.Orexin和MCH神經(jīng)元在發(fā)育不同時期數(shù)量和三維分布模式變化Orexin和MCH神經(jīng)元從P1到P21的整體分布三維模式?jīng)]有明顯變化,僅在P14MCH神經(jīng)元喙側(cè)的腹側(cè)部分,觀察到該部分的神經(jīng)元數(shù)量有明顯增加,并且這種改變持續(xù)至P21和成年。Orexin和MCH神經(jīng)元的總數(shù)量均在P14達(dá)到成年水平,且在P21維持總數(shù)量的不變。但各亞腦區(qū)的數(shù)量在發(fā)育過程中存在一些差異:orexin神經(jīng)元在PeF_2區(qū)的P7到P14間,以及LHA_2區(qū)的P1到P7間,數(shù)量有明顯的增加(n=3,P0.05);MCH神經(jīng)元在DMH_2區(qū)的P7到P14間,以及LHA_2區(qū)的P1到P7間,數(shù)量有明顯的增加(P0.05)。而在我們觀察的整個發(fā)育時期,DMH_2區(qū)的orexin神經(jīng)元和PeF_2區(qū)的MCH神經(jīng)元在數(shù)量上有輕度增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(n=3,P0.05)。這些結(jié)果表明,orexin和MCH神經(jīng)元的總數(shù)量均在P14時達(dá)到成年水平,但由不同亞腦區(qū)的數(shù)量增長造成的。綜上所述,我們探討了小鼠HP以orexin為主體的區(qū)域內(nèi)與MCH、GABA神經(jīng)元的分布模式,建立起整體和各亞腦區(qū)的三維分布模式,對已有研究做了補(bǔ)充和完善,更加直觀、具體、詳細(xì)的觀察以神經(jīng)元而非腦區(qū)為主體的整體形態(tài),在三維空間上更好的還原腦中的立體圖像,有利于功能環(huán)路的精確定位。對于orexin和MCH神經(jīng)元的出生后發(fā)育變化的形態(tài)學(xué)研究,通過探索出生后兩種神經(jīng)元發(fā)育變化的三維分布和形態(tài)特征,可以幫助我們進(jìn)一步明確其解剖機(jī)制,從形態(tài)學(xué)發(fā)育的角度加深對功能行為正常發(fā)展變化的認(rèn)識。
【圖文】：

圖 1 Amria5.4.1 軟件圖形用戶界面。（A）通道選擇以及 voxel size 設(shè)定。（B）LabelField 模塊對 orexin 和 MCH 神經(jīng)元進(jìn)行 1 比 1 標(biāo)記示意。2.1.2.7 神經(jīng)元計數(shù)，單個神經(jīng)元大小和徑向距離測量兩位經(jīng)驗豐富的實驗者分別統(tǒng)計和計算 orexin 和 MCH 神經(jīng)元的數(shù)量，以減少錯誤。當(dāng)發(fā)生大的偏差時，第三位實驗者重新計數(shù)。在 Adobe Photoshop CS6 軟件中手動計數(shù) orexin 和 MCH 神經(jīng)元的數(shù)量。選擇具有清晰核的神經(jīng)元用于細(xì)胞計數(shù)分析。在 ZEN 數(shù)字成像軟件中隨機(jī)選擇神經(jīng)元測量大小。每只小鼠在每 2 張切片中選擇 1~2個神經(jīng)元進(jìn)行測量，選擇具有清晰核的神經(jīng)元，確定神經(jīng)元直徑：橫斷面長徑（transectionmajor axis, TMaA）和橫斷面短徑（transection major axis, TMiA）（圖 2）。在 Adobe Photoshop CS6 軟件中測量 orexin 和 MCH 神經(jīng)元徑向分布距離：喙側(cè)-尾側(cè)（rostra caudal, R-C）軸、背側(cè)-腹側(cè)（dorsal ventral, D-V）軸、內(nèi)側(cè)-外側(cè)（medial lateral,

對 orexin 和 MCH 神經(jīng)元進(jìn)行 1 比 1 標(biāo)記示意。2.1.2.7 神經(jīng)元計數(shù)，單個神經(jīng)元大小和徑向距離測量兩位經(jīng)驗豐富的實驗者分別統(tǒng)計和計算 orexin 和 MCH 神經(jīng)元的數(shù)量，，以減少錯誤。當(dāng)發(fā)生大的偏差時，第三位實驗者重新計數(shù)。在 Adobe Photoshop CS6 軟件中手動計數(shù) orexin 和 MCH 神經(jīng)元的數(shù)量。選擇具有清晰核的神經(jīng)元用于細(xì)胞計數(shù)分析。在 ZEN 數(shù)字成像軟件中隨機(jī)選擇神經(jīng)元測量大小。每只小鼠在每 2 張切片中選擇 1~2個神經(jīng)元進(jìn)行測量，選擇具有清晰核的神經(jīng)元，確定神經(jīng)元直徑：橫斷面長徑（transectionmajor axis, TMaA）和橫斷面短徑（transection major axis, TMiA）（圖 2）。在 Adobe Photoshop CS6 軟件中測量 orexin 和 MCH 神經(jīng)元徑向分布距離：喙側(cè)-尾側(cè)（rostra caudal, R-C）軸、背側(cè)-腹側(cè)（dorsal ventral, D-V）軸、內(nèi)側(cè)-外側(cè)（medial lateral,M-L）軸，三個軸向距離皆為最遠(yuǎn)神經(jīng)元之間的垂直距離（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R338

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