【摘要】：研究背景異位骨化(heterotopic ossification,HO)是指在正常的骨骼系統(tǒng)之外的軟組織中發(fā)生真正成骨的病理性過程。根據(jù)發(fā)病原因一般分為兩大類:遺傳性的異位骨化(hereditary HO)與獲得性的異位骨化(acquired HO)。遺傳性的HO以進(jìn)行性纖維增生性骨發(fā)育不良(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva,FOP)最為典型,雖然發(fā)生率低,但是其病情呈進(jìn)行性且不可逆轉(zhuǎn),最終嚴(yán)重威脅患者的生命。而獲得性的HO是臨床常見的一種并發(fā)癥,常繼發(fā)于嚴(yán)重的外傷、燒傷、脊髓損傷、腦損傷等,其中又以外傷后HO最多見,因?yàn)榘l(fā)生機(jī)制仍不十分清楚,且發(fā)生率呈逐年升高趨勢,所以逐漸引起重視。目前臨床上針對獲得性HO的治療措施有限:非甾體類抗炎藥及放射治療被用作臨床上常用的兩種預(yù)防性治療措施,其適應(yīng)癥、治療時(shí)機(jī)、最終效果仍不十分明確。如果預(yù)防失敗,HO病人面臨的選項(xiàng)一般只能是手術(shù)切除治療,但手術(shù)損傷本身易引起HO復(fù)發(fā),所以對獲得性HO目前亟待解決的問題是尋找有效的治療和預(yù)防措施,而這就要求我們對HO的機(jī)理有個(gè)更深刻的理解。在發(fā)病機(jī)理方面,目前認(rèn)為HO的形成必需滿足三個(gè)條件:1)觸發(fā)因素(創(chuàng)傷);2)異常微環(huán)境;3)能分化為軟骨和成骨的前體細(xì)胞或干細(xì)胞。有證據(jù)提示:創(chuàng)傷/炎癥環(huán)境通常伴隨著低氧,而HIF-lα是一個(gè)關(guān)鍵的低氧依賴性的轉(zhuǎn)錄因子。更重要的是,有部分證據(jù)顯示,抑制HIF-lα的表達(dá)能有效防止或抑制HO發(fā)生,但具體機(jī)制不明。于是猜想HIF-lα可能參與介導(dǎo)異常免疫反應(yīng)(AIR)。事實(shí)上,創(chuàng)傷誘導(dǎo)的AIR可能是HO發(fā)生的重要機(jī)制,因?yàn)锳IR可能創(chuàng)造適宜HO的微環(huán)境或者HO所必須的前提條件。近年來免疫系統(tǒng)的作用被越來越多的關(guān)注,不管是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞還是巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及相關(guān)炎癥因子都被證明在HO進(jìn)程中扮演著不可或缺的角色。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類來源于中胚層的成體干細(xì)胞,由于其在體外培養(yǎng)可以誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞,被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前大部分學(xué)者認(rèn)同間充質(zhì)干細(xì)胞是HO形成的主要細(xì)胞來源�；谝陨险J(rèn)知,也為驗(yàn)證上述猜想,本課題組利用前期建立的HO模型—Nse-BMP4轉(zhuǎn)基因模型,經(jīng)CTX損傷肌肉可以誘導(dǎo)HO形成,驗(yàn)證是否可以通過HIF-lα抑制劑(PX-478)來抑制HO。通過檢測外周血WBC情況來分析抑制HIF-lα是否通過抑制AIR來起作用的,進(jìn)一步明確治療機(jī)理。研究方法1.將從美國西北大學(xué)(Northwestern University)引進(jìn)的Nse-BMP4轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行配種擴(kuò)繁并鑒定;2.成年的BMP4轉(zhuǎn)基因小鼠(6-8周)用心臟毒素(CTX,100ng/100ul)損傷左后肢肌肉后隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,每組5只,對照組PBS處理,實(shí)驗(yàn)組給予HIF1α抑制藥(PX-478(Apex Bio),25mg/kg),然后在處理的不同時(shí)相(1周、2周、4周)處死,取損傷部位組織;3.X線檢測:將處理4周后的小鼠進(jìn)行X線拍片(德國BRUKER,MS FX PRO)觀察損傷部位HO的形成情況,從而判斷PX-478能否有效抑制HO的發(fā)生;4.提取外周血:將成年的wt小鼠與BMP4轉(zhuǎn)基因小鼠各隨機(jī)分成4組,每組4只,分別給予不同的處理(損傷給藥組、損傷給PBS組、未損傷給藥組、未損傷給PBS組),然后在處理的不同時(shí)相(1周、2周、4周)分別進(jìn)行眼球靜脈取血;5.測外周血WBC:用血細(xì)胞分析儀(日本SYSMEX,XS-800i)檢測wt小鼠與BMP4轉(zhuǎn)基因小鼠在不同處理后不同時(shí)相的白細(xì)胞計(jì)數(shù)情況;6.提取血清檢測:從眼球靜脈取出的血中分離出血清,通過ELISA試劑盒(RD systems,DAC00B)檢測ACTA(激活素A)的表達(dá)情況;7.免疫熒光染色:通過HIF1α抗體檢測PX-478對HIF1α的抑制效果,通過各免疫細(xì)胞的標(biāo)記物(巨噬細(xì)胞-IBA1、M1型巨噬細(xì)胞-CD16/32、中性粒細(xì)胞-LY6G、B細(xì)胞及活化的T細(xì)胞-CD45R)檢測各免疫細(xì)胞的表達(dá)情況,以及檢測ACTA在組織中的表達(dá);8.WB實(shí)驗(yàn):通過WB實(shí)驗(yàn)檢測損傷部位ACTA的表達(dá)情況。研究結(jié)果1.異常免疫反應(yīng)可能介導(dǎo)了HO的發(fā)生:在Nse-BMP4轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn),在損傷早期(1-2周),外周血白細(xì)胞的數(shù)量較wt小鼠顯著上調(diào),而在損傷后期(3-4周)白細(xì)胞數(shù)量反而明顯下降;提示在Nse-BMP4轉(zhuǎn)基因小鼠損傷早期免疫反應(yīng)增強(qiáng),而后期免疫反應(yīng)減低(或者被抑制);2.X片結(jié)果顯示HIF1α抑制劑PX-478可以有效抑制HO的形成;3.HIF1α抑制劑PX-478治療結(jié)果提示,在損傷早期不管是在外周血中還是在損傷部位,白細(xì)胞的數(shù)量都明顯減少,說明PX-478可以抑制免疫炎癥反應(yīng)。結(jié)論1.異常免疫反應(yīng)促進(jìn)HO的發(fā)生;2.抑制HIF1α可以抑制異常免疫反應(yīng);3.炎癥反應(yīng)相關(guān)的Activin A/HIF1α信號軸可能參與調(diào)控HO進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R68;R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 喻都;肖海軍;薛鋒;潘明芒;鞠金勇;唐果;;低氧誘導(dǎo)因子1α在大鼠跟腱創(chuàng)傷后異位骨化模型中的表達(dá)及意義[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2016年09期

2 張丹;任利玲;;缺氧誘導(dǎo)因子1α在組織工程成骨和成血管中的作用[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2016年04期

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