發(fā)布時(shí)間：2020-05-08 12:06

【摘要】：目的：本實(shí)驗(yàn)探討了缺血預(yù)處理對(duì)腎缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用，通過(guò)與單純?nèi)毖?再灌注相比較，從生化、細(xì)胞組織和蛋白水平闡明缺血預(yù)處理抗大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的作用，為抗腎臟缺血-再灌注損傷提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 選用36只SPF級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠(SD大鼠，250-300g)，隨機(jī)分為3組。假手術(shù)組(Sham operated control，Sham組，n=12)：大鼠常規(guī)麻醉后行開(kāi)腹手術(shù)，立即切除右腎用作正常腎臟標(biāo)本，游離左側(cè)腎蒂血管，不夾閉，觀察73min關(guān)閉腹部；缺血-再灌注組(Ischemia Reperfusion，I/R組，n=12)：切除右腎，左腎蒂血管分離，觀察28min后用無(wú)損傷動(dòng)脈夾持續(xù)夾閉左腎蒂血管45min后，恢復(fù)左腎血流，關(guān)閉腹部；缺血預(yù)處理組(Isehemic Preconditioning，IPC組，n=12)：立即切除右腎，左腎蒂血管分離，行4個(gè)循環(huán)夾閉左腎蒂血管2min/再灌注5min預(yù)處理后，無(wú)損傷動(dòng)脈持續(xù)夾閉45min，恢復(fù)左腎血流，關(guān)閉腹部。各組于再灌注后4h、6h、24h三個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采血和收獲腎臟標(biāo)本。 本研究分為兩個(gè)部分： 1.缺血預(yù)處理抗大鼠腎缺血-再灌注損傷作用 應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清肌酐(Serum creatinine，SCR)、尿素氮(Blood UreaNitrogen，BUN)評(píng)價(jià)腎臟功能；Hematoxylin and eosin染色（HE染色）觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變，評(píng)價(jià)缺血預(yù)處理抗大鼠腎臟缺血-再灌傷作用。 2.缺血預(yù)處理抗大鼠腎缺血-再灌注損傷的相關(guān)蛋白研究 2.1從抗細(xì)胞凋亡途徑研究缺血預(yù)處理抗大鼠腎臟缺血-再灌注損傷作用 應(yīng)用末端脫氧核苦酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nickend labeling，TUNEL法)檢測(cè)大鼠腎組織細(xì)胞凋亡發(fā)生情況；采用免疫印跡（westernblot）法分別測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)情況，透射電鏡觀察腎臟組織凋亡現(xiàn)象。 2.2從自噬相關(guān)途徑研究缺血預(yù)處理抗大鼠腎缺血-再灌注損傷作用 采用western blot法測(cè)定自噬相關(guān)蛋白Beclin-l的表達(dá)情況，，透射電鏡觀察腎臟組織自噬現(xiàn)象。 結(jié)果： 1.缺血預(yù)處理抗大鼠腎缺血-再灌注損傷作用 ①腎功能的評(píng)價(jià)：sham組BUN水平在假缺血再灌注后4h，6h，24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為7.72±0.66mmol/L、9.73±1.23mmol/L、9.68±1.50mmol/L， SCR水平為61.13±10.33μmol/L、61.38±9.14μmol/L、87.48±16.50μmol/L；IPC組BUN水平在缺血再灌注后4h，6h，24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為9.80±0.75mmol/L、14.13±2.30mmol/L、20.37±4.23mmol/L， SCR水平為86.88±16.94μmol/L、92.55±25.41μmol/L、171.83±33.22μmol/L；I/R組BUN水平在缺血再灌注后4h，6h，24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為10.47±0.79mmol/L、18.34±2.28mmol/L、33.42±6.41mmol/L， SCR水平為94.35±16.34μmol/L、127.43±15.28μmol/L、261.88±33.37μmol/L。腎臟缺血再灌注損傷后各組BUN，SCR水平較Sham組均有上升，差別有顯著性意義(P㩳0.05)。IPC組BUN，SCR的水平于再灌注后4h較同時(shí)間點(diǎn)I/R組相比較差別無(wú)顯著性意義，6h、24h水平較同時(shí)間點(diǎn)I/R組相比較差別有顯著性意義(P㩳0.05)。 ②腎組織病理學(xué)觀察：正常對(duì)照組及sham組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)明顯差異。IPC組再灌注后4h、6h及24h組織學(xué)評(píng)分分別為4.20±0.22、4.60±0.42、5.93±0.46；I/R組再灌注后4h、6h及24h組織學(xué)評(píng)分分別為4.58±0.54、5.45±0.53、7.28±0.95；IPC組再灌注后6h、24h腎組織損傷評(píng)分較I/R組同時(shí)間點(diǎn)減低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 2.缺血預(yù)處理抗大鼠腎缺血-再灌注損傷的相關(guān)蛋白研究 ①腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果：腎臟再灌注4h有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，I/R、IPC組再灌注后細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)較sham組明顯增高(P0.05)；再灌注后6h、24hIPC組凋亡指數(shù)與同時(shí)間點(diǎn)I/R組凋亡指數(shù)比較明顯降低(P0.05)。 ②細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況：正常腎臟組織Bcl-2和Bax表達(dá)及Bcl-2/Bax比值較Sham組無(wú)顯著差異；而與Sham組比較，I/R、IPC組再灌注后各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2及Bax表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.05)，Bcl-2/Bax比值增加(P0.05)。IPC組較I/R組Bcl-2表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.05)，Bax表達(dá)明顯下降(P0.05)，Bcl-2/Bax比值增加(P0.05)。 ③自噬相關(guān)蛋白Beclin-l表達(dá)情況：Sham組Beclin-l表達(dá)與正常對(duì)照組腎臟比較無(wú)顯著差異(P0.05)；而與Sham組比較，I/R、IPC組再灌注后各時(shí)間點(diǎn)Beclin-l表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.05)。IPC組較I/R組Beclin-l表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.05)。 ④透射電鏡觀察自噬及凋亡的發(fā)生：透射電鏡觀察顯示正常及假手術(shù)對(duì)照組腎臟組織少見(jiàn)自噬體及凋亡現(xiàn)象產(chǎn)生；缺血再灌注后4小時(shí)可見(jiàn)少量自噬體，細(xì)胞凋亡仍較難見(jiàn)到；至再灌注后6小時(shí)自噬小體開(kāi)始增多，可見(jiàn)細(xì)胞凋亡；再灌注損傷后24小時(shí)，自噬體數(shù)量顯著增多，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)塊狀邊集，核形態(tài)不規(guī)則的明顯凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論： 1.腎缺血-再灌注使大鼠腎功能和結(jié)構(gòu)受損，表現(xiàn)為SCR和BUN升高，腎小球、腎小管受損。缺血預(yù)處理能降低SCR和BUN水平，減輕腎組織結(jié)構(gòu)的損傷，具有顯著的抗大鼠腎缺血-再灌注損傷的作用。 2.大鼠腎缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腎小管細(xì)胞凋亡增加，缺血預(yù)處理抗缺血再灌注損傷作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，缺血預(yù)處理能顯著抑制腎組織細(xì)胞凋亡，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值升高。大鼠腎缺血再灌注損傷能同時(shí)激活腎臟組組織自噬發(fā)生，且早于凋亡和細(xì)胞壞死前發(fā)生，缺血預(yù)處理的抗缺血再灌注損傷作用可能還與上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

正常腎臟(6000倍)

圖 4-3-E圖 4-3-F圖 4-3 各組大鼠缺血再灌注后 4h、6h、24 h 腎臟組織促凋亡蛋白 BAX 及抗凋亡蛋白 Bcl-2Western blot 電泳圖N：正常腎臟；sham:對(duì)照組；I/R:缺血再灌注組；IPC:缺血預(yù)處理組
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李超;伏圣博;劉華玲;馬欣榮;;細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[J];世界科技研究與發(fā)展;2007年03期

2 尚瑩;陸羨;;腫瘤治療過(guò)程中凋亡與自噬的關(guān)系[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年04期

本文編號(hào)：2654628