【摘要】：S-層蛋白是位于一些細(xì)菌細(xì)胞壁外層的一種蛋白成分。乳酸桿菌的S-層蛋白對(duì)其發(fā)揮益生功能具有重要作用。許多研究證實(shí)乳酸菌定殖于宿主腸道中,能夠?qū)λ拗鞯拿庖呦到y(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于S-層蛋白對(duì)宿主細(xì)胞TLR4-My D88-NF-κB信號(hào)通路的影響的研究較少,所以本課題以脂多糖(LPS)作為炎性刺激物,研究從Lactobacillus paracasei subsp.paracasei M5-L和Lactobacillus casei Q8-L兩種乳酸桿菌上分離的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞的TLR4-My D88-NF-κB信號(hào)通路的影響。本研究采取5 mol/L的Li Cl提取S-層蛋白,并利用1 mol/L的Li Cl通過鹽析的方法來純化粗提蛋白,SDS-PAGE檢測(cè)表明兩株菌均在45 k Da處有單一條帶。調(diào)整S-層蛋白濃度作用細(xì)胞,經(jīng)WST-8實(shí)驗(yàn)最終確定其作用濃度為150μg/m L,活菌體與熱滅活菌體的濃度為107 cfu/m L和108 cfu/m L,脂多糖(LPS)與細(xì)胞作用的最佳濃度是10μg/m L,作用時(shí)間為6 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。WST-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在作用時(shí)間為6 h時(shí),兩種S-層蛋白、活菌體與熱滅活菌體能夠抑制LPS對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響,并且預(yù)防組具有明顯的效果。通過對(duì)細(xì)胞上清液中NO含量的檢測(cè),證明兩種S-層蛋白、活菌體、熱滅活菌體能夠顯著降低LPS引起的細(xì)胞過度分泌NO。通過ELISA測(cè)定細(xì)胞分泌的IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的水平,進(jìn)一步通過Western Blot法對(duì)HT-29細(xì)胞的TLR-My D88-NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵酶從蛋白水平進(jìn)行研究。結(jié)果表明S-層蛋白、活菌體和熱滅活菌體均能抑制炎性因子IL-10和IL-1β,并且對(duì)細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白TLR2/4、My D88、TRAF6、IκB-α和NF-κB-p65進(jìn)行調(diào)節(jié),進(jìn)而對(duì)宿主細(xì)胞的免疫作用進(jìn)行調(diào)控。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT-29細(xì)胞凋亡情況,證實(shí)兩種S-層蛋白均能夠調(diào)節(jié)LPS導(dǎo)致的細(xì)胞周期紊亂的狀態(tài),并對(duì)LPS誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞大量增加的情況進(jìn)行抑制,進(jìn)一步證實(shí)了S-層蛋白能通過對(duì)LPS的抑制作用進(jìn)而保護(hù)宿主細(xì)胞。研究也表明S-層蛋白、活菌體、熱滅活菌體能夠通過拮抗細(xì)胞Caspase-1的活性,進(jìn)而抑制LPS引起的細(xì)胞炎性,通過對(duì)Caspase-3、Caspase-9活性的降低,進(jìn)而減少LPS引起的細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

對(duì)菌株M5-L及Q8-L的S-層蛋白采用5 mol/L LiCl進(jìn)行了粗提取，粗提取的S-層蛋白通過1 mol/L LiCl進(jìn)行純化。用SDS-PAGE檢測(cè)S-層蛋白的提取和純化情況，見圖3-1。如圖3-1所示，在45 KDa處均能看見清晰的電泳條帶，這與文獻(xiàn)中描述的S-層蛋白的分子量范圍一致。對(duì)比經(jīng)1 mol/L LiCl純化前后的S-層蛋白，，條帶1、2與5、6具有專一的條帶，純化效果較好�？梢赃M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)外研究使用NaOH、LiCl、溶菌酶、鹽酸胍、pH分別為4.0和7.3的PBS對(duì)乳酸桿菌的S-層蛋白進(jìn)行提取，結(jié)果表明，5 mol/L LiCl提取的S-層蛋白含量

圖 3-3 不同濃度 LPS 對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig. 3-3 Effect of different concentrations of LPS on cell viability同濃度的 S-層蛋白對(duì) HT-29 細(xì)胞活性的影響分別研究了濃度為50、100、150、200 μg/mL的乳酸桿菌M在6、12、18、24 h處理HT-29細(xì)胞后，對(duì)其活性的影響。b)
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R371

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2652844