【摘要】：S-層蛋白是位于一些細菌細胞壁外層的一種蛋白成分。乳酸桿菌的S-層蛋白對其發(fā)揮益生功能具有重要作用。許多研究證實乳酸菌定殖于宿主腸道中,能夠對宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的調節(jié)作用。目前關于S-層蛋白對宿主細胞TLR4-My D88-NF-κB信號通路的影響的研究較少,所以本課題以脂多糖(LPS)作為炎性刺激物,研究從Lactobacillus paracasei subsp.paracasei M5-L和Lactobacillus casei Q8-L兩種乳酸桿菌上分離的S-層蛋白對HT-29細胞的TLR4-My D88-NF-κB信號通路的影響。本研究采取5 mol/L的Li Cl提取S-層蛋白,并利用1 mol/L的Li Cl通過鹽析的方法來純化粗提蛋白,SDS-PAGE檢測表明兩株菌均在45 k Da處有單一條帶。調整S-層蛋白濃度作用細胞,經WST-8實驗最終確定其作用濃度為150μg/m L,活菌體與熱滅活菌體的濃度為107 cfu/m L和108 cfu/m L,脂多糖(LPS)與細胞作用的最佳濃度是10μg/m L,作用時間為6 h進行后續(xù)實驗。WST-8實驗證實了在作用時間為6 h時,兩種S-層蛋白、活菌體與熱滅活菌體能夠抑制LPS對HT-29細胞增殖的影響,并且預防組具有明顯的效果。通過對細胞上清液中NO含量的檢測,證明兩種S-層蛋白、活菌體、熱滅活菌體能夠顯著降低LPS引起的細胞過度分泌NO。通過ELISA測定細胞分泌的IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的水平,進一步通過Western Blot法對HT-29細胞的TLR-My D88-NF-κB信號通路中關鍵酶從蛋白水平進行研究。結果表明S-層蛋白、活菌體和熱滅活菌體均能抑制炎性因子IL-10和IL-1β,并且對細胞中關鍵蛋白TLR2/4、My D88、TRAF6、IκB-α和NF-κB-p65進行調節(jié),進而對宿主細胞的免疫作用進行調控。流式細胞術檢測HT-29細胞凋亡情況,證實兩種S-層蛋白均能夠調節(jié)LPS導致的細胞周期紊亂的狀態(tài),并對LPS誘導的凋亡細胞大量增加的情況進行抑制,進一步證實了S-層蛋白能通過對LPS的抑制作用進而保護宿主細胞。研究也表明S-層蛋白、活菌體、熱滅活菌體能夠通過拮抗細胞Caspase-1的活性,進而抑制LPS引起的細胞炎性,通過對Caspase-3、Caspase-9活性的降低,進而減少LPS引起的細胞凋亡。
【圖文】：

對菌株M5-L及Q8-L的S-層蛋白采用5 mol/L LiCl進行了粗提取，粗提取的S-層蛋白通過1 mol/L LiCl進行純化。用SDS-PAGE檢測S-層蛋白的提取和純化情況，見圖3-1。如圖3-1所示，在45 KDa處均能看見清晰的電泳條帶，這與文獻中描述的S-層蛋白的分子量范圍一致。對比經1 mol/L LiCl純化前后的S-層蛋白，，條帶1、2與5、6具有專一的條帶，純化效果較好�？梢赃M行后續(xù)實驗。國內外研究使用NaOH、LiCl、溶菌酶、鹽酸胍、pH分別為4.0和7.3的PBS對乳酸桿菌的S-層蛋白進行提取，結果表明，5 mol/L LiCl提取的S-層蛋白含量

圖 3-3 不同濃度 LPS 對細胞存活率的影響Fig. 3-3 Effect of different concentrations of LPS on cell viability同濃度的 S-層蛋白對 HT-29 細胞活性的影響分別研究了濃度為50、100、150、200 μg/mL的乳酸桿菌M在6、12、18、24 h處理HT-29細胞后，對其活性的影響。b)
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R371

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 盧千慧;張英春;張?zhí)m威;;乳酸桿菌S-層蛋白性質及其益生功能研究進展[J];微生物學通報;2014年01期

2 XU Guang-yong;JIANG Jin-qi;WANG Ming;LI Jie;SU Jing-liang;REN Xiao-ming;;Lactic Acid Reduces LPS-Induced TNF-a and IL-6 mRNA Levels Through Decreasing I?Ba Phosphorylation[J];Journal of Integrative Agriculture;2013年06期

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4 王伯瑤,黃寧,吳琦;炎癥反應Toll信號傳導通路[J];中國病理生理雜志;2000年06期

相關碩士學位論文 前1條

1 盧千慧;乳酸桿菌表面蛋白的黏附性及對腸上皮細胞的保護作用研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2014年

本文編號：2652844