【摘要】：目的隨著人們對代謝性疾病的廣泛關注,已有諸多研究表明在一些代謝性疾病中,膽汁酸以及膽汁酸信號通路已經成為潛在的治療靶點,例如:糖尿病、肥胖以及膽結石病。糖尿病腦病是糖尿病的一種并發(fā)癥,是一種復雜的代謝性疾病,伴隨著中樞神經和腦功能損傷,表現為認知功能障礙,使得患老年癡呆的風險增加。對糖尿病腦病的發(fā)病機制以及臨床上的治療方法已有很多報道,主要包括對腦組織中的各種神經細胞及神經遞質的研究,以及臨床上采用的中樞神經刺激的治療方法。但是,至今仍沒有膽汁酸代謝在糖尿病腦病的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用的相關報道。所以,本課題的研究目的是在糖尿病腦病這種復雜的疾病模型中探索膽汁酸代謝及其信號通路。有文獻表明,糖尿病的發(fā)生會導致迷走神經的病變,而迷走神經對于膽汁酸的代謝和信號通路的影響尚沒有系統的研究。作為尋找糖尿病腦病的潛在預防治療靶點的第一步,我們試著探尋迷走神經在膽汁酸體內平衡中的調節(jié)作用。方法 為了定量檢測生物組織和體液中的膽汁酸濃度,進而對生物體內的膽汁酸代謝進行分析,首先建立了簡單有效的液相色譜-質譜聯用(LC-MS)方法。該方法經過了線性、穩(wěn)定性、準確度、精密度、檢測線(LOD)、定量限(LOQ)、回收率、基質效應等驗證。生物體內組織和體液中膽汁酸的提取采用簡便的四步提取法:1.乙腈沉淀蛋白;2.震蕩提取;3.離心后上清干燥;4.50%甲醇-水(雙蒸水)復溶,樣品前處理完成后等待進樣檢測。糖尿病腦病動物模型的建立采用C57BL/6小鼠,實驗組小鼠長期喂養(yǎng)高脂飲食,糖尿病組和糖尿病腦病組小鼠經單次注射鏈脲霉素(STZ)誘導。模型構建后期,用水迷宮試驗(Morris water maze test)判斷小鼠疾病階段,將小鼠分成四組,分別為正常組(NC)、高脂飲食組(HFD)、糖尿病組(unDCD)及糖尿病腦病組(DCD)。模型建立成功后,將小鼠麻醉并收集小鼠肝臟、腸道及結腸。用液相色譜-質譜聯用方法(LC-MS)定量測定肝臟和腸道中膽汁酸的濃度;并采用逆轉錄聚合酶鏈式反應實時熒光定量技術(RT-PCR)和蛋白免疫印跡技術(Western Blot)檢測肝臟和腸道中與膽汁酸相關的基因表達情況;采用定量PCR技術檢測分析結腸內容物中細菌總量的變化和各類細菌百分比含量的變化。為了探究迷走神經對膽汁酸代謝以及信號通路的調控作用,本研究繼而建立了大鼠(Wistar)膈下迷走神經切斷模型,模型構建成功后,對大鼠進行麻醉,收集膽汁、血液、肝臟、腸道以及結腸。采用液相色譜-質譜聯用技術定量測定膽汁、肝臟以及血清中膽汁酸濃度。并采用逆轉錄聚合酶鏈式反應實時熒光定量技術和蛋白免疫印跡技術檢測肝臟和腸道中膽汁酸相關的基因表達情況。結果 糖尿病腦病小鼠模型建立過程中,觀察到高脂飼料喂養(yǎng)持續(xù)五周后,四組小鼠中的體重差異顯現,高脂飲食組(HFD)小鼠體重相比于正常飲食組(NC)小鼠體重顯著增加了19%,然而糖尿病(unDCD)和糖尿病腦病(DCD)組小鼠體重卻有所減輕,尤其糖尿病腦病組小鼠體重比正常組小鼠顯著下降了12%。飼養(yǎng)第六周時,三組實驗組小鼠的空腹血糖水平相比正常對照組升高,糖尿病組和糖尿病腦病組小鼠血糖相比于高脂喂養(yǎng)組小鼠血糖均顯著升高了約1.3倍。血脂檢測中,實驗組小鼠的總膽固醇含量相比正常組顯著升高;甘油三酯的含量在糖尿病腦病小鼠中顯著升高,在糖尿病小鼠中升高但無統計學意義;相比正常組,低密度脂蛋白含量在糖尿病和糖尿病腦病小鼠中均顯著性升高,高密度脂蛋白在糖尿病小鼠中顯著升高,在腦病小鼠中增加不明顯(約44%)。在用于觀察小鼠學習及記憶能力的水迷宮實驗中,得到如下結果:在為期五天的觀察中,從第三天開始小鼠的記憶能力差異顯現,糖尿病腦病組小鼠逃避潛伏時間顯著長于其它三組小鼠;首次到達平臺的時間顯著高于正常組,相比糖尿病組小鼠慢了約3s;穿越平臺的次數相比高脂飲食組和糖尿病組減少一次,相比正常組小鼠減少四次。糖尿病腦病模型研究中膽汁酸濃度定量檢測的結果顯示,同正常組(NC)以及高脂飲食組(HFD)相比,在糖尿病(unDCD)和糖尿病腦病(DCD)小鼠的肝臟和腸道中總膽汁酸的含量均明顯升高,尤其在糖尿病腦病小鼠中總膽汁酸的升高存在統計學差異。糖尿病小鼠肝臟中總膽汁酸的升高主要是由于如下幾類膽汁酸含量的增加引起的,TMCA增加了259%,TMDCA增加了153%,TCDCA增加了342%,然而幾種非結合型膽汁酸顯著降低,CA降低60%,βMCA降低38%,DCA降低80%,導致肝臟中非結合型膽汁酸總量降低了55%。糖尿病腦病小鼠肝臟中不僅總膽汁酸含量升高,初級膽汁酸和結合型膽汁酸的總量也分別升高,有幾種膽汁酸濃度變化明顯,TMCA增加了212%,TCA增加了102%,TCDCA增加了279%,CA增加了39%,CDCA增加了46%,isoCDCA增加了403%。糖尿病腦病小鼠腸道中初級膽汁酸和結合型膽汁酸的總量同樣顯著升高,TMCA,TCA,TUDCA,TCDCA,TDCA,和isoCDCA顯著增加,CA和αMCA顯著降低。和正常組(NC)小鼠相比,高脂飲食組(HFD)小鼠中肝臟和腸道總膽汁酸濃度均無明顯變化,雖然肝臟中總膽汁酸的含量無明顯變化,但是個別的膽汁酸含量產生了明顯變化,TLCA增加了486%,TDCA增加了101%,CA降低了36%,CDCA增加了83%,DCA增加了81%,βMCA降低了34%,MDCA增加了478%,isoCDCA增加了732%。糖尿病腦病小鼠中,肝臟中膽汁酸濃度異常增加,而肝細胞膽汁酸外排轉運體Ostα,Ostβ,和Mrp4基因明顯上調,說明這是一種機體自身的反饋調節(jié)機制。此外,糖尿病腦病小鼠肝臟中膽汁酸合成酶Cyp7a1,Cyp8b1,Cyp7b1和Cyp27a1的mRNA都顯著性降低,Cyp7a1的蛋白水平也有著顯著下降。糖尿病腦病小鼠腸道的Fxr-Fgf15信號通路被激活,Fgf15的mRNA及蛋白水平均顯著上調,Fxr-Fgf15信號通路的激活可能是導致肝臟中膽汁酸合成限速酶Cyp7a1被抑制的主要原因。結腸內容物中細菌的檢測中,糖尿病腦病組小鼠細菌總量明顯減少,其中三種細菌Bacteroidetes,Tenericutes,和β-proteobacteria顯著降低。并且,腸細胞中膽汁酸重吸收轉運體Asbt,Ostα和Ostβ的mRNA水平顯著升高。次級膽汁酸在腸道中形成,細菌菌種Bacteroidetes中存在著細菌膽酸鹽水解酶(BSH),這種酶使得結合型膽汁酸水解脫去甘氨酸和�；撬醾孺�,最終使得結合型膽汁酸水解生成非結合型膽汁酸。Asbt是膽汁酸在腸道中進行主動吸收的主要轉運體(鈉離子依賴性轉運體),位于回腸頂膜中,負責將腸道內容物中的膽汁酸主動轉運到腸細胞中,細胞內膽汁酸與腸道膽汁酸結合蛋白(Ibabp)結合并被攜帶到腸道基底外側膜上,基底膜上存在膽汁酸轉運蛋白Ostα和Ostβ,負責將腸細胞中的膽汁酸轉運到肝門靜脈中,Asbt,Ibabp,Ostα和Ostβ構成腸道中膽汁酸重吸收的轉運系統。細菌Bacteroidetes的降低和腸道重吸收轉運體的增加可能是肝臟中結合型膽汁酸增多的主要原因。我們還發(fā)現,和正常組小鼠相比,其它三組小鼠肝臟中四羥基膽汁酸濃度顯著降低,導致這個現象的一部分原因可能是因為膽汁酸羥化酶Cyp3a11的下調。我們還檢測到在糖尿病及糖尿病腦病小鼠的肝臟中,膽汁酸硫酸化酶Sult2a1的mRNA水平顯著增加,說明膽汁酸硫酸化可能是在糖尿病腦病發(fā)展過程中機體降低膽汁酸毒性的一個機制。實驗大鼠進行膈下迷走神經切斷后,相比于假手術組大鼠體重的逐天增加,手術組大鼠體重幾乎保持不變。手術后第七天時,手術組大鼠體重相比假手術組降低了約19%,這是早期臨床上用這種手術治療肥胖的主要原因。兩組大鼠的體重/肝重值、血液谷丙轉氨酶(ALT)含量、血液總膽紅素(TBIL)含量均無變化,說明該手術模型沒有產生肝臟損傷。手術后第七天時對膽汁流速進行了監(jiān)測,發(fā)現迷走神經切斷大鼠的膽汁流速顯著高于假手術組大鼠,一小時內迷走神經切斷大鼠的膽汁流量相比假手術大鼠高了約18%。大鼠迷走神經切斷手術模型膽汁酸分析中,我們發(fā)現在迷走神經切斷手術大鼠膽汁、血清和肝臟中都存在非結合型膽汁酸及次級膽汁酸濃度明顯升高的現象,這也導致了在這些組織和體液中膽汁酸的疏水性顯著增加。膽汁中,結合型膽汁酸TMCA降低了36%,TMDCA增加了1.2倍,GCDCA增加了4.9倍,GDCA增加了6.5倍,GLCA則增加了8.1倍;幾乎所有的非結合型膽汁酸均有所升高,如CA升高了5倍,ωMCA升高了4.8倍,βMCA升高了3.9倍,CDCA升高了4.2倍,7-oxo-HDCA升高了63倍,12-oxo-CA升高了9.4倍。此外,四羥基膽汁酸12α-OH-ωMCA、12α-OH-βMCA、6α-OH-CA均升高了10-15倍,硫酸化膽汁酸UDCA-3S升高了10倍,CDCA-3S升高了3.7倍。血清中,主要的結合型膽汁酸TMCA、TCA、TUDCA、THDCA、TCDCA和TDCA沒有發(fā)生變化,但甘氨酸結合型膽汁酸GCDCA增加1.1倍,GDCA增加了1.3倍;非結合型膽汁酸除βMCA、UDCA及LCA外均有顯著增加。肝臟中,只有TMDCA(升高1.6倍)、THDCA(降低53倍)、GCDCA(升高3倍)、UDCA(升高67倍)和iso-CDCA(升高1.1倍)五種膽汁酸的變化存在顯著性,這導致非結合型膽汁酸的總量升高了約2倍,但統計學上沒有顯著性差異。迷走神經切斷后,肝臟膽汁酸合成經典途徑中膽汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1顯著降低,膽汁酸合成替代途徑中膽汁酸合成關鍵酶Cyp7b1同樣降低但無顯著性差異,在兩種合成途徑中均起作用的膽汁酸合成酶Cyp27a1卻沒有變化。肝臟中膽汁酸調控信號通路中Fxr和Shp的基因和蛋白水平均無變化,說明迷走神經切斷大鼠肝臟的Fxr-Shp信號通路不是抑制膽汁酸合成酶的原因。我們發(fā)現,腸道中膽汁酸調節(jié)信號通路中Fgf15的基因和蛋白水平均顯著性增加,腸道Fxr-Fgf15信號通路被激活,可見Cyp7a1等膽汁酸合成酶的降低是由于受到了腸道Fxr-Fgf15信號通路的調節(jié)。再者,由于腸道中Fxr-Shp信號通路被激活,導致腸道膽汁酸重吸收轉運體Asbt被抑制。我們又發(fā)現腸道膜結構中的緊密連接蛋白Claudin-5和Occludin的蛋白水平顯著降低,這可能是引起血液和膽汁中非結合型膽汁酸顯著增加的原因。對于膽汁酸轉運體的檢測,腸道中除了膽汁酸重吸收轉運體Asbt顯著下調外,腸道Ostα和Ostβ沒有受到影響,肝臟中幾種主要膽汁酸轉運體均沒有顯著性變化。結論 我們的研究表明,糖尿病腦病小鼠中腸道細菌的改變使得腸道和肝臟中膽汁酸增多(主要為結合型膽汁酸和初級膽汁酸),這激活了腸道Fxr-Fgf15信號通路,通過負反饋調節(jié)機制抑制了肝臟中膽汁酸合成酶Cyp7a1,進而抑制肝臟中膽汁酸的合成。同時我們的研究表明迷走神經受損的大鼠體內非結合型膽汁酸濃度異常升高,激活了腸道中Fxr-Fgf15信號通路,抑制了肝臟膽汁酸合成限速酶Cyp7a1,從而證實了迷走神經參與了膽汁酸代謝的調節(jié)及膽汁酸信號通路的調控。
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R747.9;R-332

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本文編號：2652262