【摘要】：[目的與背景]全球丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus, HCV)的感染人數(shù)約為1.85億,占總?cè)藬?shù)的3%,而且每年新增感染人數(shù)還在迅速增長,發(fā)展中國家HCV感染尤為嚴(yán)重,東亞地區(qū)高達(dá)3.7%。大約有20%左右的HCV感染者可以自愈,但是絕大多數(shù)(70%-80%)則會發(fā)展成為慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC),如果不及時(shí)進(jìn)行治療,CHC患者中有四分之一將逐漸發(fā)展為肝硬化(liver cirrhosis, LC)甚至肝癌(primary liver cancer, PLC)。因此HCV感染嚴(yán)重威脅著人民的生活質(zhì)量和身體健康。由于標(biāo)準(zhǔn)抗病毒方案副反應(yīng)大、病毒應(yīng)答率低,因此尋找新的直接抗病毒藥物成為研究的熱點(diǎn)。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5B (non-structural protein 5B,NS5B)是一個(gè)相對分子量為68kDa的RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase, RdRp),在HCV復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,缺少了NS5B RdRp, HCV基因就不能從單鏈RNA合成雙鏈RNA。NS5B蛋白又稱為尾錨定蛋白,其C端是由21個(gè)氨基酸組成的高度疏水區(qū)域構(gòu)成的α-螺旋結(jié)構(gòu),參與復(fù)制復(fù)合物在感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的組裝過程,N端構(gòu)成HCV NS5B的催化活性中心。NS5B RdRp不但在HCV復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,還參與調(diào)解HCV的解旋酶活性。同時(shí)由于宿主細(xì)胞中不表達(dá)與NS5BRdRp功能類似的酶,針對NS5B RdRp的抑制劑選擇性非常強(qiáng)。因此,從NS5B RNA聚合酶著手,研究抗HCV的藥物具有廣闊的前景。虛擬篩選(virtual screening)最早是指根據(jù)靶標(biāo)的活性位點(diǎn)或已知的活性化合物的結(jié)構(gòu)特征,從化合物庫中挑選活性分子的藥物設(shè)計(jì)方法。隨著虛擬篩選技術(shù)的不斷完善及發(fā)展,虛擬篩選的范圍也不斷擴(kuò)大�，F(xiàn)在,虛擬篩選除了上述內(nèi)容外,還包括應(yīng)用特定的技術(shù)篩選具有特定性質(zhì)的靶標(biāo)。因此,隨著虛擬篩選技術(shù)越來越快的發(fā)展,新藥的研發(fā)將得到極大的推動。分子對接(molecular docking)是藥物設(shè)計(jì)的方法之一,主要研究配體與受體間的相互作用,預(yù)測它們結(jié)合力的強(qiáng)弱以及結(jié)合模式。進(jìn)行分子對接時(shí)配體和受體之間要滿足空間結(jié)構(gòu)以及能量的匹配,自由能是受體和配體結(jié)合過程中一個(gè)非常重要的概念。它從整體出發(fā),研究配體和受體結(jié)合的效果,也是研究蛋白質(zhì)分子間互相作用的一種有效手段,有利于先導(dǎo)化合物的研發(fā)。目前在抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域,分子對接技術(shù)已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。分子模擬軟件能夠預(yù)測配基與受體之間的親和力,提高命中合成物的幾率,降低實(shí)驗(yàn)成本,縮短研發(fā)周期,因此越來越到受人們的青睞。借助計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù),充分發(fā)揮天然蛋白質(zhì)分子的特異性和合成配基的穩(wěn)定性,進(jìn)而篩選出高親和性的配基,這是進(jìn)行藥物篩選的一個(gè)非常有發(fā)展前途的新思路。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一系列不同長度的多肽組合庫,利用分子對接軟件,將多肽與HCV NS5B RNA聚合酶上特定的抑制性位點(diǎn)進(jìn)行分子對接,通過軟件評分系統(tǒng)對對接結(jié)果進(jìn)行評定,并對結(jié)果進(jìn)行綜合分析,以期篩選出具有抑制HCV NS5BRNA聚合酶活性的多肽,為進(jìn)一步研發(fā)抗HCV藥物奠定基礎(chǔ)。第一部分HCV NS5B RNA聚合酶抑制多肽虛擬篩選1目的借助虛擬篩選技術(shù),利用分子對接軟件對NS5B RNA聚合酶的多肽抑制劑進(jìn)行初步虛擬設(shè)計(jì)。2方法利用分子對接軟件SYBYL-X2.0來完成。設(shè)計(jì)包含NS5B RNA聚合酶催化活性關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的活性口袋。采用逐個(gè)氨基酸延長的方法,設(shè)計(jì)能夠與HCV NS5BRNA聚合酶最佳結(jié)合的多肽序列。利用SYBYL/MOLCAD模塊自動生成NS5B RNA聚合酶／多肽的溶劑表面,計(jì)算此表面上的范德華力、靜電相互作用、氫鍵結(jié)合性和疏水性。3結(jié)果(1)篩選出12條能夠與HCV NS5B RNA聚合酶最佳結(jié)合的多肽序列,所設(shè)計(jì)的活性口袋完全涵蓋了HCV NS5B聚合酶Thumb區(qū)的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。(2)范德華力是一種非常重要的作用力；Asp220、Thr221、Asn291、Asp318、 Asp319、Gly317等區(qū)域的靜電作用都比較強(qiáng),多肽與HCV NS5B結(jié)合時(shí)形成一定的靜電相互作用；氫鍵在配基與目標(biāo)蛋白之間的親和力中作用巨大。4結(jié)論篩選出的12條氨基酸序列均能與HCV NS5B RNA聚合酶結(jié)合。第二部分HCV NS5B RNA聚合酶的體外表達(dá)和純化1目的構(gòu)建HCV NS5B全長蛋白(NF)、C端21個(gè)氨基酸缺失蛋白(N-21)和C端51個(gè)氨基酸缺失蛋白(N-51)三種表達(dá)載體,并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。2方法采用基因工程手段,對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,構(gòu)建表達(dá)載體；將建立成功的三種質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后用BamH I和Xho I進(jìn)行酶切鑒定；對目的蛋白的表達(dá)體系進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化及鎳柱純化。3結(jié)果(1)三種質(zhì)粒和目的片段大小與預(yù)期大小一致,說明所構(gòu)建質(zhì)粒符合要求。(2)酶切質(zhì)粒大小為5360bp,目的片段大小分別為1773bp、1720bp和1620bp。當(dāng)IPTG的濃度為1.1mmM、誘導(dǎo)3h時(shí),目的蛋白的表達(dá)效果最佳。(3)表達(dá)蛋白經(jīng)過鎳柱純化可以明顯提高目的蛋白的純度。4結(jié)論成功構(gòu)建符合實(shí)驗(yàn)要求的表達(dá)載體,三種長度的HCV NS5B表達(dá)蛋白均可正常表達(dá)。第三部分HCV NS5B RNA聚合酶表達(dá)蛋白體外活性鑒定1目的鑒定表達(dá)蛋白的活性。2方法將表達(dá)蛋白進(jìn)行Western-Blot分析,構(gòu)建表達(dá)NS5B蛋白與多肽結(jié)合的ELISA體系。建立NS5B蛋白體外活性鑒定體系,對NS5B聚合酶的濃度和反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。3結(jié)果(1)3個(gè)蛋白經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后與HCV感染陽性血清均能反應(yīng),在55-70KDa處有一條清晰的反應(yīng)條帶。(2)設(shè)計(jì)的多肽均能與表達(dá)蛋白結(jié)合,N-21表達(dá)融合蛋白測定結(jié)果和虛擬對接結(jié)果之間有一定的相關(guān)性。(3)建立NS5B蛋白體外活性鑒定體系時(shí),當(dāng)反應(yīng)體系中加入10μI濃度為10μg/ml的NS5B蛋白、反應(yīng)時(shí)間為30min時(shí),表達(dá)的NS5B RNA聚合酶活性最佳。(4)3種NS5B表達(dá)蛋白的聚合酶活性Km值：NF為5.0μM、N-21為2.9μ M、N-51為2.5 μ M。4結(jié)論本研究表達(dá)的不同長度HCV NS5B融合蛋白均有正常的NS5B蛋白活性和聚合酶活性,其Km值也完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。第四部分HCV NS5B RNA聚合酶抑制性多肽的篩選與鑒定1目的對HCV NS5B RNA聚合酶抑制性多肽進(jìn)行篩選與鑒定。2方法利用本研究建立的HCV NS5B RNA聚合酶體外活性鑒定體系進(jìn)行多肽抑制篩選。3結(jié)果篩選的12條多肽中,P72和P84對3種蛋白的聚合酶活性均有顯著抑制作用,P72的IC50為9.85μ M,P84的IC50為13.57μ M。4結(jié)論通過虛擬篩選得到的HCV RNA聚合酶抑制性多肽能夠抑制NS5B蛋白的生物學(xué)活性。
【圖文】：

邐第一部分ＨＣＶＮ巧ＢＲＮＡ聚合酶抑制性多化虛擬篩選邐逡逑對接結(jié)果顯示，活性曰袋和多膚均可形成強(qiáng)烈的氨鍵區(qū)域（見圖１－４，圖中紫逡逑色部分）。對對接結(jié)果的分析可知，多r烙牖钚鑰詿尚緯沙保按Π奔饔茫義賢跡保擔(dān)賈謝粕橄擼�，虽仍挶键的作用力比介e。瞧渥饔檬慷�，因此，辶x習(xí)奔彩嵌嗷氳鞍紫嗷プ饔昧χ蟹淺Ｖ匾囊徊糠腫饔謾ｅ義，

本文編號：2652995