【摘要】：[目的與背景]全球丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus, HCV)的感染人數(shù)約為1.85億,占總人數(shù)的3%,而且每年新增感染人數(shù)還在迅速增長,發(fā)展中國家HCV感染尤為嚴重,東亞地區(qū)高達3.7%。大約有20%左右的HCV感染者可以自愈,但是絕大多數(shù)(70%-80%)則會發(fā)展成為慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC),如果不及時進行治療,CHC患者中有四分之一將逐漸發(fā)展為肝硬化(liver cirrhosis, LC)甚至肝癌(primary liver cancer, PLC)。因此HCV感染嚴重威脅著人民的生活質(zhì)量和身體健康。由于標準抗病毒方案副反應大、病毒應答率低,因此尋找新的直接抗病毒藥物成為研究的熱點。HCV非結構蛋白5B (non-structural protein 5B,NS5B)是一個相對分子量為68kDa的RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase, RdRp),在HCV復制過程中發(fā)揮關鍵作用,缺少了NS5B RdRp, HCV基因就不能從單鏈RNA合成雙鏈RNA。NS5B蛋白又稱為尾錨定蛋白,其C端是由21個氨基酸組成的高度疏水區(qū)域構成的α-螺旋結構,參與復制復合物在感染細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的組裝過程,N端構成HCV NS5B的催化活性中心。NS5B RdRp不但在HCV復制過程中發(fā)揮關鍵作用,還參與調(diào)解HCV的解旋酶活性。同時由于宿主細胞中不表達與NS5BRdRp功能類似的酶,針對NS5B RdRp的抑制劑選擇性非常強。因此,從NS5B RNA聚合酶著手,研究抗HCV的藥物具有廣闊的前景。虛擬篩選(virtual screening)最早是指根據(jù)靶標的活性位點或已知的活性化合物的結構特征,從化合物庫中挑選活性分子的藥物設計方法。隨著虛擬篩選技術的不斷完善及發(fā)展,虛擬篩選的范圍也不斷擴大�，F(xiàn)在,虛擬篩選除了上述內(nèi)容外,還包括應用特定的技術篩選具有特定性質(zhì)的靶標。因此,隨著虛擬篩選技術越來越快的發(fā)展,新藥的研發(fā)將得到極大的推動。分子對接(molecular docking)是藥物設計的方法之一,主要研究配體與受體間的相互作用,預測它們結合力的強弱以及結合模式。進行分子對接時配體和受體之間要滿足空間結構以及能量的匹配,自由能是受體和配體結合過程中一個非常重要的概念。它從整體出發(fā),研究配體和受體結合的效果,也是研究蛋白質(zhì)分子間互相作用的一種有效手段,有利于先導化合物的研發(fā)。目前在抗腫瘤藥物研究領域,分子對接技術已經(jīng)得到越來越廣泛的應用。分子模擬軟件能夠預測配基與受體之間的親和力,提高命中合成物的幾率,降低實驗成本,縮短研發(fā)周期,因此越來越到受人們的青睞。借助計算機分子模擬技術,充分發(fā)揮天然蛋白質(zhì)分子的特異性和合成配基的穩(wěn)定性,進而篩選出高親和性的配基,這是進行藥物篩選的一個非常有發(fā)展前途的新思路。本試驗設計了一系列不同長度的多肽組合庫,利用分子對接軟件,將多肽與HCV NS5B RNA聚合酶上特定的抑制性位點進行分子對接,通過軟件評分系統(tǒng)對對接結果進行評定,并對結果進行綜合分析,以期篩選出具有抑制HCV NS5BRNA聚合酶活性的多肽,為進一步研發(fā)抗HCV藥物奠定基礎。第一部分HCV NS5B RNA聚合酶抑制多肽虛擬篩選1目的借助虛擬篩選技術,利用分子對接軟件對NS5B RNA聚合酶的多肽抑制劑進行初步虛擬設計。2方法利用分子對接軟件SYBYL-X2.0來完成。設計包含NS5B RNA聚合酶催化活性關鍵氨基酸位點的活性口袋。采用逐個氨基酸延長的方法,設計能夠與HCV NS5BRNA聚合酶最佳結合的多肽序列。利用SYBYL/MOLCAD模塊自動生成NS5B RNA聚合酶／多肽的溶劑表面,計算此表面上的范德華力、靜電相互作用、氫鍵結合性和疏水性。3結果(1)篩選出12條能夠與HCV NS5B RNA聚合酶最佳結合的多肽序列,所設計的活性口袋完全涵蓋了HCV NS5B聚合酶Thumb區(qū)的關鍵活性位點。(2)范德華力是一種非常重要的作用力；Asp220、Thr221、Asn291、Asp318、 Asp319、Gly317等區(qū)域的靜電作用都比較強,多肽與HCV NS5B結合時形成一定的靜電相互作用；氫鍵在配基與目標蛋白之間的親和力中作用巨大。4結論篩選出的12條氨基酸序列均能與HCV NS5B RNA聚合酶結合。第二部分HCV NS5B RNA聚合酶的體外表達和純化1目的構建HCV NS5B全長蛋白(NF)、C端21個氨基酸缺失蛋白(N-21)和C端51個氨基酸缺失蛋白(N-51)三種表達載體,并在大腸桿菌中進行表達。2方法采用基因工程手段,對目的基因進行擴增,構建表達載體；將建立成功的三種質(zhì)粒分別進行PCR擴增,然后用BamH I和Xho I進行酶切鑒定；對目的蛋白的表達體系進行系統(tǒng)優(yōu)化及鎳柱純化。3結果(1)三種質(zhì)粒和目的片段大小與預期大小一致,說明所構建質(zhì)粒符合要求。(2)酶切質(zhì)粒大小為5360bp,目的片段大小分別為1773bp、1720bp和1620bp。當IPTG的濃度為1.1mmM、誘導3h時,目的蛋白的表達效果最佳。(3)表達蛋白經(jīng)過鎳柱純化可以明顯提高目的蛋白的純度。4結論成功構建符合實驗要求的表達載體,三種長度的HCV NS5B表達蛋白均可正常表達。第三部分HCV NS5B RNA聚合酶表達蛋白體外活性鑒定1目的鑒定表達蛋白的活性。2方法將表達蛋白進行Western-Blot分析,構建表達NS5B蛋白與多肽結合的ELISA體系。建立NS5B蛋白體外活性鑒定體系,對NS5B聚合酶的濃度和反應時間等條件進行優(yōu)化。3結果(1)3個蛋白經(jīng)過誘導表達后與HCV感染陽性血清均能反應,在55-70KDa處有一條清晰的反應條帶。(2)設計的多肽均能與表達蛋白結合,N-21表達融合蛋白測定結果和虛擬對接結果之間有一定的相關性。(3)建立NS5B蛋白體外活性鑒定體系時,當反應體系中加入10μI濃度為10μg/ml的NS5B蛋白、反應時間為30min時,表達的NS5B RNA聚合酶活性最佳。(4)3種NS5B表達蛋白的聚合酶活性Km值：NF為5.0μM、N-21為2.9μ M、N-51為2.5 μ M。4結論本研究表達的不同長度HCV NS5B融合蛋白均有正常的NS5B蛋白活性和聚合酶活性,其Km值也完全滿足后續(xù)實驗要求。第四部分HCV NS5B RNA聚合酶抑制性多肽的篩選與鑒定1目的對HCV NS5B RNA聚合酶抑制性多肽進行篩選與鑒定。2方法利用本研究建立的HCV NS5B RNA聚合酶體外活性鑒定體系進行多肽抑制篩選。3結果篩選的12條多肽中,P72和P84對3種蛋白的聚合酶活性均有顯著抑制作用,P72的IC50為9.85μ M,P84的IC50為13.57μ M。4結論通過虛擬篩選得到的HCV RNA聚合酶抑制性多肽能夠抑制NS5B蛋白的生物學活性。
【圖文】：

邐第一部分ＨＣＶＮ巧ＢＲＮＡ聚合酶抑制性多化虛擬篩選邐逡逑對接結果顯示，活性曰袋和多膚均可形成強烈的氨鍵區(qū)域（見圖１－４，圖中紫逡逑色部分）。對對接結果的分析可知，多r烙牖钚鑰詿尚緯沙保按Π奔饔茫義賢跡保擔賈謝粕橄擼淙話奔淖饔昧Ρ冉閑�，但是其作用数量多，因此，辶x習奔彩嵌嗷氳鞍紫嗷プ饔昧χ蟹淺Ｖ匾囊徊糠腫饔謾ｅ義，

本文編號：2652995