【摘要】：急性酒精性肝損傷是指短時(shí)間內(nèi)攝入大量酒精,致使血液中酒精濃度超肝臟的代謝能力而引起的肝細(xì)胞受損等一系列改變。急性酒精性肝損傷所涉及的分子通路十分復(fù)雜,部分研究已經(jīng)解釋了可能參與急性酒精性肝損傷過程的潛在機(jī)制,但其在基因表達(dá)中的分子機(jī)制仍有待闡明。一系列相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究得出,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在急慢性肝損傷形成過程中起著重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是機(jī)體存在的防御保護(hù)機(jī)制,但應(yīng)激太強(qiáng)或者持續(xù)時(shí)間太長(zhǎng),就可能會(huì)引起炎癥和凋亡等的發(fā)生,可引發(fā)一系列的病理性改變。然而,ERS參與急慢性肝損傷,尤其是急性酒精性肝損傷的機(jī)制尚有待闡明。單次酒精灌胃所誘導(dǎo)的肝損傷是用于研究急性酒精性肝損傷比較常用的方法之一。本研究首先觀察了急性酒精性肝損傷模型中合適的內(nèi)參基因,并進(jìn)一步研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)外泌體mi R-122表達(dá)的影響,主要內(nèi)容如下:1.急性酒精性肝損傷小鼠模型中內(nèi)參基因的選擇由于單個(gè)常見的內(nèi)參基因不可能在所有條件下都是適用的,所以對(duì)于特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),不同內(nèi)參基因的實(shí)用性必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了更深入研究酒精誘導(dǎo)急性肝損傷的分子機(jī)制,選擇穩(wěn)定可靠的內(nèi)參基因至關(guān)重要。1.1 ge Norm,Best Keeper和Norm Finder工具用于評(píng)估急性酒精性肝損傷小鼠模型中內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性我們采用單次酒精灌胃來構(gòu)建急性酒精性肝損傷小鼠模型,取同等大小的一小部分肝組織進(jìn)行HE和TUNEL染色,留取小鼠血液靜置離心后獲得的血清用于谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)的檢測(cè),再稱取小鼠的肝重和體重后算得小鼠的肝重系數(shù)(肝重/體重)以鑒定建模成功。通過q PCR技術(shù)檢測(cè)肝組織中內(nèi)參基因(Actb,Gapdh,Gusb,Hprt1,18S,Tbp,B2m)的表達(dá)量。使用ge Norm,Norm Finder和Best Keeper工具評(píng)估急性酒精性肝損傷小鼠模型中內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在酒精誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中Hprt1和Gapdh的組合在急性酒精性肝損傷小鼠模型中被證實(shí)為最佳內(nèi)參基因?qū)?Hprt1表達(dá)最穩(wěn)定。1.2不同內(nèi)參基因的選擇對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平的影響在急性酒精性肝損傷小鼠模型中,選擇在該模型中表達(dá)最穩(wěn)定基因Hprt1和最不穩(wěn)定基因18S作為內(nèi)參基因來檢測(cè)ERS相關(guān)基因(GRP78,CHOP,GRP94,XBP1,XBP1t,ERdj4,PDI)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,使用Hprt1作為內(nèi)參基因,酒精12h組肝臟GRP78,CHOP,PDI基因表達(dá)水平均顯著升高。而使用18S作為內(nèi)參基因,對(duì)照組和酒精組的基因表達(dá)水平之間無明顯差異。上述結(jié)果提示,Hprt1是通過三種內(nèi)參評(píng)估工具選擇的可作為小鼠急性酒精性肝損傷模型中合適的內(nèi)參基因。2.急性酒精性肝損傷小鼠模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)外泌體mi R-122表達(dá)的影響外泌體(exosomes)最近成了研究的熱點(diǎn),其為含有脂質(zhì)雙層特征結(jié)構(gòu)的小膜泡。外泌體內(nèi)含有不同類別的mi RNAs和m RNAs等活性物質(zhì),與相近細(xì)胞膜融合,將活性物質(zhì)傳遞到受體細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。有研究證實(shí)外泌體中含有豐富多種mi RNAs,其脂質(zhì)雙層的膜結(jié)構(gòu)可提高mi RNAs的被檢測(cè)性,能夠成為研究mi RNAs可以信賴的載體。在急性酒精性肝損傷中,酒精可直接或間接導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。ERS在肝損傷進(jìn)展過程中起著一定的作用。4-苯基丁酸(PBA)作為ERS抑制劑被廣泛應(yīng)用于研究與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的疾病。研究表明,PBA能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以達(dá)到降低肝細(xì)胞壞死和凋亡的程度的效果。另有研究顯示,酒精性肝損傷過程中存在外泌體mi R-122表達(dá)水平的上調(diào)。因此,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究ERS在急性酒精性肝損傷中對(duì)血清外泌體mi R-122表達(dá)水平的影響。2.1 4-苯基丁酸對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響為進(jìn)一步研究ERS在急性酒精性肝損傷中對(duì)血清外泌體mi R-122表達(dá)水平的影響。我們采用單次酒精灌胃來構(gòu)建急性酒精性肝損傷的小鼠模型,PBA干預(yù)組小鼠在造模前12 h和24 h腹腔注射不同劑量的PBA(75 mg/kg,150 mg/kg),取同等大小的一小部分肝組織進(jìn)行HE染色,留取小鼠血液離心后獲得血清用于ALT的檢測(cè),算得小鼠肝重系數(shù)鑒定建模成功。Western blot技術(shù)檢測(cè)小鼠肝臟組織中ERS相關(guān)蛋白GRP78,p IRE1α和p e IF2α的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,PBA能抑制ERS相關(guān)蛋白的表達(dá),150 mg/kg劑量的PBA對(duì)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制效果更明顯。2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)外泌體mi R-122表達(dá)的影響在急性酒精性肝損傷模型組和PBA干預(yù)組中,使用Western blot技術(shù)檢測(cè)小鼠肝臟組織中ERS相關(guān)蛋白GRP78,p IRE1α和p e IF2α的表達(dá)情況,q PCR檢測(cè)血清外泌體pri-mi R-122,mi R-122表達(dá)情況。結(jié)果顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致外泌體pri-mi R-122,mi R-122表達(dá)水平上調(diào),而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA可使外泌體pri-mi R-122,mi R-122表達(dá)水平下調(diào)。上述結(jié)果提示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可影響外泌體mi R-122的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R-332;R575

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 Jian Zhang;Sha Li;Lu Li;Meng Li;Chongye Guo;Jun Yao;Shuangli Mi;;Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2015年01期

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本文編號(hào)：2650945