【摘要】：甲型流感病毒(influenza A virus)是嚴(yán)重威脅人類健康的病原體之一,一直以來備受疾病防治領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)是流感病毒外層的兩個(gè)主要糖蛋白,它們?cè)诹鞲胁《镜纳芷谥衅鹬P(guān)鍵的作用。因HA和NA的特殊功能,二者已成為流感病毒抑制類分子設(shè)計(jì)的主要靶點(diǎn)。甲型H1N1亞型流感病毒曾引起多次世界范圍內(nèi)的大流行,針對(duì)該亞型病毒的新型抑制類分子研究是當(dāng)前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨著實(shí)驗(yàn)篩選合成技術(shù)以及計(jì)算機(jī)輔助工具的不斷發(fā)展,越來越多的以HA及NA為靶點(diǎn)的潛在小分子抑制劑以及廣譜中和抗體被發(fā)現(xiàn),這對(duì)抗流感病毒藥物發(fā)展提供了極大的便利。然而,想要更充分地利用這些新型抑制類分子進(jìn)行新藥開發(fā),必須從理論層面深入了解其微觀作用機(jī)理。但當(dāng)前理論研究的步伐卻遠(yuǎn)不及新型抑制類分子發(fā)現(xiàn)的速度,已知作用機(jī)制的抑制分子數(shù)目仍極為有限。因此,基于實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果的更深層次的抑制劑理論機(jī)理研究尤為必要。本文將利用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬以及結(jié)合自由能計(jì)算等多種理論計(jì)算方法從分子、原子等角度來研究幾種以甲型H1N1流感病毒外層蛋白HA和NA為靶點(diǎn)的潛在抑制劑小分子、以及大分子抗體的微觀作用機(jī)理。本文具體的研究內(nèi)容包含以下三個(gè)部分:1、一種甲型H1N1流感病毒HA蛋白小分子抑制劑的結(jié)合及抑制機(jī)制研究在之前的研究當(dāng)中,Arnab等人利用高通量篩選技術(shù)獲得了一種名為MBX2329的小分子,該小分子能夠通過抑制H1N1亞型流感病毒HA的酸變構(gòu),進(jìn)而破壞病毒膜與細(xì)胞膜膜融合的潛力。該小分子的發(fā)現(xiàn)對(duì)于新甲型H1N1流感病毒抑制劑的開發(fā)有著重要的意義,然而該分子與H1N1 HA的動(dòng)態(tài)結(jié)合機(jī)制及抑制機(jī)理尚未得到具體研究。本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)選取了兩種不同的甲型H1N1流感毒株(A/Washington/10/2008 H1N1和A/Florida/21/2008 H1N1)的HA及小分子抑制劑MBX2329為主要研究對(duì)象,應(yīng)用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、結(jié)合自由能計(jì)算等理論研究方法研究MBX2329在中性條件下與HA的結(jié)合機(jī)制并探究MBX2329在酸性條件下抑制HA變構(gòu)的機(jī)理。研究表明,在中性條件下,MBX2329可以通過范德華作用力與HA的頸部區(qū)穩(wěn)定結(jié)合,這一結(jié)合可協(xié)助小分子隨著HA通過胞飲過程進(jìn)入胞飲小泡。模擬胞飲小泡內(nèi)部酸性條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MBX2329可在酸性條件下移動(dòng)到一個(gè)新的保守口袋處行使其抑制效力。經(jīng)分析,MBX2329在酸性條件下的結(jié)合可以有效地阻止HA1與HA2的分離,且進(jìn)一步維持HA2內(nèi)部長、短螺旋以及Loop環(huán)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,保護(hù)Glu101和Lys50之間的鹽橋,進(jìn)而有效阻止HA三聚體在酸性條件下的解聚行為。本研究考察的新結(jié)合口袋殘基十分保守,其有潛力成為新的藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。研究結(jié)果為將來以抑制HA變構(gòu)為目標(biāo)而進(jìn)行的藥物設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。2、一種靶向甲型H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶的小分子抑制劑機(jī)理研究在之前的研究當(dāng)中,Wang等人報(bào)道了一種潛在NA抑制劑7a,該小分子能夠同時(shí)抑制A/Puerto Rico/8/34(H1N1)NA(NA_(PR))和A/California/04/09(H1N1)NA(NA_(CA))的活性。然而據(jù)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)顯示NA_(PR)和NA_(CA)活性中心口袋存在明顯的差異。NA_(PR)屬于典型的進(jìn)化枝1 NA,在其活性位點(diǎn)區(qū)域具備150空腔這一拓展結(jié)構(gòu),而09年大流行期間毒株的NA_(CA)活性中心上則缺少這一空腔。小分子7a的這種能夠以可觀的抑制效果同時(shí)抑制兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上存在差異的NA的能力,使我們對(duì)其潛在的抑制機(jī)制產(chǎn)生了極大的興趣。為了進(jìn)一步地探究7a的抑制機(jī)理,本章應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬,拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬,結(jié)合自由能計(jì)算等理論方法對(duì)7a的功能進(jìn)行了研究。研究表明,7a可以同時(shí)以氫鍵、陽離子共軛等微觀作用力結(jié)合于上述兩種在結(jié)構(gòu)上存在差異的NA活性中心。7a以一種相對(duì)舒展的姿勢(shì)結(jié)合在存在150空腔的NA_(PR)活性中心,而7a在與缺少150空腔的NA_(CA)結(jié)合時(shí)則傾向于結(jié)合在活性口袋靠近150-環(huán)的一側(cè)。進(jìn)一步的理論結(jié)果顯示,7a的環(huán)狀結(jié)構(gòu)在NA活性口袋的適應(yīng)方式在很大程度上決定了其結(jié)合位置,而7a硼酸結(jié)構(gòu)則負(fù)責(zé)進(jìn)一步穩(wěn)定小分子的結(jié)合。由于150空腔的存在,NA_(PR)的活性中心口袋較為寬闊,7a的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以很容易的與活性中心周圍的正電氨基酸殘基結(jié)合。相比之下,NA_(CA)由于缺少150空腔,其活性口袋較為狹窄,導(dǎo)致7a的環(huán)狀結(jié)構(gòu)傾向首先與150-環(huán)及430-環(huán)上暴露的正電殘基結(jié)合,7a在NA_(CA)活性口袋的適應(yīng)過程中影響了NA_(CA)局部結(jié)構(gòu),導(dǎo)致了類150空腔的形成,為7a進(jìn)一步地與NA_(CA)穩(wěn)定結(jié)合提供了保障。該結(jié)果揭示了7a可能存在的廣譜結(jié)合機(jī)制,為以后該類抗流感藥物的發(fā)展提供了新的理論線索。3、一種靶向甲型H1N1流感病毒HA頸部區(qū)的廣譜中和抗體的動(dòng)態(tài)抑制機(jī)制研究靶向作用物與流感病毒表面蛋白之間的作用機(jī)制一直備受關(guān)注。治療性廣譜中和抗體的作用機(jī)制研究與小分子抑制類藥物的研究同樣迫切。最近,Wang等報(bào)道了一株名為3E1的人源單克隆抗體,通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證明,3E1能夠通過抑制HA蛋白的變構(gòu)而有效地對(duì)抗H1及H5亞型的流感病毒感染。3E1 Fab段與兩株H1N1 HA單體的復(fù)合物已經(jīng)在晶體實(shí)驗(yàn)中得到,但3E1與HA之間的動(dòng)態(tài)作用機(jī)制仍未深入研究。本章將利用同源模建、分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法研究廣譜中和抗體3E1的動(dòng)態(tài)抑制行為。另外,根據(jù)實(shí)驗(yàn)顯示,HA2亞基第45號(hào)殘基的I45F突變將會(huì)降低3E1對(duì)于HA的結(jié)合活性,而該突變是如何影響3E1與HA_(I45F)結(jié)合的,尚未在理論層面深入考究。因此,在本部分研究中,我們也具體分析了I45F突變對(duì)HA_(I45F)-3E1復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定性的影響。理論結(jié)果表明,3E1的結(jié)合可以降低HA2長螺旋上端的擾動(dòng);同時(shí)3E1能夠保護(hù)Glu101和Lys50之間的鹽橋,維持HA2長短螺旋的穩(wěn)定,進(jìn)而抑制長螺旋底部105至107號(hào)殘基附近的翻轉(zhuǎn)回折。此外,通過對(duì)突變體HA_(I45F)與3E1之間的動(dòng)態(tài)行為研究發(fā)現(xiàn),I45F突變會(huì)破壞HA2短螺旋與3E1的HCDR3區(qū)以及輕鏈Trp32之間的疏水作用,從而減弱3E1與HA的結(jié)合,進(jìn)而導(dǎo)致3E1抗體重鏈結(jié)合位置下移,同時(shí)會(huì)完全破壞3E1的輕鏈與HA的有效接觸。上述結(jié)果揭示了3E1抗體的作用行為,其可作為提高抗體廣譜性設(shè)計(jì)的依據(jù),為今后以3E1為基礎(chǔ)的治療性抗體改造與設(shè)計(jì)提供了理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)果對(duì)于流感病毒的防治研究具有重大的意義。HA和NA與其抑制類分子微觀作用的闡明,可明確特異性抗流感藥物的設(shè)計(jì)思路,指導(dǎo)廣譜性中和抗體的改造方向,亦可為流感病毒候選免疫原的設(shè)計(jì)提供理論線索。
【圖文】：

圖 1.1 二十世紀(jì)以來對(duì)人類社會(huì)造成較1.1.2流感病毒顆粒的結(jié)構(gòu)與組分成熟流感病毒顆粒的形狀毒外殼骨架以及病毒核心新分離出來的流感病毒株毒擁有八段單股的負(fù)鏈丙型流感病毒 RNA 鏈則為七段二十世紀(jì)以來對(duì)人類社會(huì)造成較大影響的甲型流感流行年份呈球形，其外到內(nèi)的整體結(jié)構(gòu)分別為病毒包膜毒外殼骨架以及病毒核心。流感病毒顆粒的直徑范圍在 80 至 120多為絲狀。如圖 1.2 所示，甲型流感病毒RNA，分別是 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA[14]。流行年份。其外到內(nèi)的整體結(jié)構(gòu)分別為病毒包膜、病納米之間，而甲型流感病毒和乙型流感病、M、NS。

二十世紀(jì)以來對(duì)人類社會(huì)造成較病毒顆粒的結(jié)構(gòu)與組分感病毒顆粒的形狀以及病毒核心的流感病毒株單股的負(fù)鏈毒 RNA 鏈則為七段二十世紀(jì)以來對(duì)人類社會(huì)造成較大影響的甲型流感流行年份呈球形，，其外到內(nèi)的整體結(jié)構(gòu)分別為病毒包以及病毒核心。流感病毒顆粒的直徑范圍在 80 至 120多為絲狀。如圖 1.2 所示，甲型流感病毒RNA，分別是 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA[14]。流行年份其外到內(nèi)的整體結(jié)構(gòu)分別為病毒包納米之甲型流感病毒和乙型、M
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373.13

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2650910