【摘要】：幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,Hp.)在全球有較高的感染率,是唯一種能在胃酸環(huán)境下定植的病原菌。H.pylori的定植改變了胃部的酸性環(huán)境,并釋放毒性物質(zhì),誘發(fā)一系列慢性甚至惡性胃部疾病。卵黃免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin,IgY)可以由特異性受體激發(fā),在鳥類的B淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生經(jīng)由血清運送到卵黃當(dāng)中的天然抗體,IgY可以通過產(chǎn)生被動免疫保護作用對由病原菌、病毒等引發(fā)的人畜疾病起到治療效果。目的選取H.pylori免疫原性強的致病因子黏附素(Hpa A)、尿素酶B亞基(Ure B)、I亞基(Ure I)克隆至真核表達(dá)載體。再將克隆的真核表達(dá)重組質(zhì)粒作為抗原,免疫蛋雞生產(chǎn)制備特異性卵黃抗體(IgY)后檢驗其生物學(xué)活性。為研究與開發(fā)針對幽門螺桿菌的預(yù)防性保健食品和臨床診斷試劑及治療奠定基礎(chǔ)。方法與結(jié)果利用PCR技術(shù)分別將H.pylori的Hpa A、Ure B、Ure I基因進行擴增,通過雙酶切法將目的基因分別克隆至p ET28a(+)和p CMV-tag2B兩種質(zhì)粒上。再分別將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)至蛋白表達(dá)工程菌和真核細(xì)胞中進行目的蛋白的表達(dá);得到具有活性的目的蛋白,經(jīng)凝膠層析法初步純化后,通過SDS-PAGE和Western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)情況以及表達(dá)量的大小。結(jié)果顯示,真核表達(dá)與原核表達(dá)的蛋白都有良好的特異性免疫反應(yīng),說明重組的真核表達(dá)質(zhì)粒具備進行活體免疫的可行性。制備去除內(nèi)毒素的三種真核表達(dá)重組質(zhì)粒,用p CMV-tag2B-Hpa A、p CMV-tag2B-Ure B、p CMV-tag2B-Ure I以及三種質(zhì)粒的等比混合物分別免疫蛋雞,并將純化后的Hpa A、Ure B、Ure I三種蛋白抗原作為對照組一同進行免疫。收集雞蛋,水稀釋法結(jié)合PEG沉淀后再利用DEAE-Sephorose Fast Flow凝膠過濾柱層析純化后,測定抗H.pylori的特異性卵黃抗體(Hp.-IgY)的生物學(xué)活性,Western blot結(jié)果各組Hp.-IgY都能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合,有良好的免疫反應(yīng)性;間接ELISA結(jié)果顯示DNA免疫蛋雞所產(chǎn)生的特異性IgY的效價能達(dá)到與蛋白抗原免疫蛋雞所產(chǎn)生的特異性IgY效價水平;凝集實驗顯示Hp.-IgY與H.pylori能在體外發(fā)生凝集沉淀。結(jié)論本課題通過以上實驗論證了構(gòu)建Hpa A、Ure B、Ure I基因疫苗的可行性,并通過DNA免疫獲得了與傳統(tǒng)免疫方式效價接近的特異性的卵黃抗體蛋白,且經(jīng)檢測其具備良好的生物學(xué)活性,初步探究了一條簡單經(jīng)濟的幽門螺旋桿菌IgY抗體制備途徑,為幽門螺旋桿菌的預(yù)防性保健食品及臨床治療與診斷試劑的研究開發(fā)創(chuàng)造了條件。
【圖文】：

經(jīng)由血液累積到卵黃當(dāng)中，并且他們從被免疫母雞所產(chǎn)雞應(yīng)的特異性抗體。而當(dāng)時這一經(jīng)典實驗并未收到重視，直taak 等人[38]提出“IgY 技術(shù)”這一概念。一年后，IgY 技術(shù)被的生產(chǎn)和應(yīng)用[39]。體(IgY) 來自于禽蛋制品產(chǎn)量豐富并且成本低廉，相比較產(chǎn)具有很明顯的優(yōu)勢。進一步對其理化性質(zhì)的研究表明其生物學(xué)上，它在動物種系發(fā)生學(xué)上存在距離的優(yōu)勢, 這些性抗體被大量生產(chǎn)的價值[40]。IgY 的被動免疫功能在抑制有很大潛力, 這一潛力在開發(fā)新型藥物和功能性食品中開的結(jié)構(gòu)和功能

圖 2-2 pET28a(+)和 pCMV-tag2B 質(zhì)粒圖譜Fig.2-2 pET28a(+) and pcmv-tag2b plasmid.PCR 反應(yīng)體系配置如下組分 體積2×Taq Plus Master Mix 25 μL引物 Forward（10μM） 2.0 μL引物 Reverse（10μM） 2.0 μL模板 DNA 1.0 μLddH2O 20 μLTotal 50 μL按以上體系將各組分分別加入到 0.2 mL Ep 管中，用移液槍輕輕吹打混勻后入 PCR 儀，按以下程序設(shè)定反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2650776