【摘要】：幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,Hp.)在全球有較高的感染率,是唯一種能在胃酸環(huán)境下定植的病原菌。H.pylori的定植改變了胃部的酸性環(huán)境,并釋放毒性物質(zhì),誘發(fā)一系列慢性甚至惡性胃部疾病。卵黃免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin,IgY)可以由特異性受體激發(fā),在鳥(niǎo)類的B淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生經(jīng)由血清運(yùn)送到卵黃當(dāng)中的天然抗體,IgY可以通過(guò)產(chǎn)生被動(dòng)免疫保護(hù)作用對(duì)由病原菌、病毒等引發(fā)的人畜疾病起到治療效果。目的選取H.pylori免疫原性強(qiáng)的致病因子黏附素(Hpa A)、尿素酶B亞基(Ure B)、I亞基(Ure I)克隆至真核表達(dá)載體。再將克隆的真核表達(dá)重組質(zhì)粒作為抗原,免疫蛋雞生產(chǎn)制備特異性卵黃抗體(IgY)后檢驗(yàn)其生物學(xué)活性。為研究與開(kāi)發(fā)針對(duì)幽門螺桿菌的預(yù)防性保健食品和臨床診斷試劑及治療奠定基礎(chǔ)。方法與結(jié)果利用PCR技術(shù)分別將H.pylori的Hpa A、Ure B、Ure I基因進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)雙酶切法將目的基因分別克隆至p ET28a(+)和p CMV-tag2B兩種質(zhì)粒上。再分別將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)至蛋白表達(dá)工程菌和真核細(xì)胞中進(jìn)行目的蛋白的表達(dá);得到具有活性的目的蛋白,經(jīng)凝膠層析法初步純化后,通過(guò)SDS-PAGE和Western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)情況以及表達(dá)量的大小。結(jié)果顯示,真核表達(dá)與原核表達(dá)的蛋白都有良好的特異性免疫反應(yīng),說(shuō)明重組的真核表達(dá)質(zhì)粒具備進(jìn)行活體免疫的可行性。制備去除內(nèi)毒素的三種真核表達(dá)重組質(zhì)粒,用p CMV-tag2B-Hpa A、p CMV-tag2B-Ure B、p CMV-tag2B-Ure I以及三種質(zhì)粒的等比混合物分別免疫蛋雞,并將純化后的Hpa A、Ure B、Ure I三種蛋白抗原作為對(duì)照組一同進(jìn)行免疫。收集雞蛋,水稀釋法結(jié)合PEG沉淀后再利用DEAE-Sephorose Fast Flow凝膠過(guò)濾柱層析純化后,測(cè)定抗H.pylori的特異性卵黃抗體(Hp.-IgY)的生物學(xué)活性,Western blot結(jié)果各組Hp.-IgY都能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合,有良好的免疫反應(yīng)性;間接ELISA結(jié)果顯示DNA免疫蛋雞所產(chǎn)生的特異性IgY的效價(jià)能達(dá)到與蛋白抗原免疫蛋雞所產(chǎn)生的特異性IgY效價(jià)水平;凝集實(shí)驗(yàn)顯示Hp.-IgY與H.pylori能在體外發(fā)生凝集沉淀。結(jié)論本課題通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)論證了構(gòu)建Hpa A、Ure B、Ure I基因疫苗的可行性,并通過(guò)DNA免疫獲得了與傳統(tǒng)免疫方式效價(jià)接近的特異性的卵黃抗體蛋白,且經(jīng)檢測(cè)其具備良好的生物學(xué)活性,初步探究了一條簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的幽門螺旋桿菌IgY抗體制備途徑,為幽門螺旋桿菌的預(yù)防性保健食品及臨床治療與診斷試劑的研究開(kāi)發(fā)創(chuàng)造了條件。
【圖文】：

經(jīng)由血液累積到卵黃當(dāng)中，并且他們從被免疫母雞所產(chǎn)雞應(yīng)的特異性抗體。而當(dāng)時(shí)這一經(jīng)典實(shí)驗(yàn)并未收到重視，直taak 等人[38]提出“IgY 技術(shù)”這一概念。一年后，IgY 技術(shù)被的生產(chǎn)和應(yīng)用[39]。體(IgY) 來(lái)自于禽蛋制品產(chǎn)量豐富并且成本低廉，相比較產(chǎn)具有很明顯的優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步對(duì)其理化性質(zhì)的研究表明其生物學(xué)上，它在動(dòng)物種系發(fā)生學(xué)上存在距離的優(yōu)勢(shì), 這些性抗體被大量生產(chǎn)的價(jià)值[40]。IgY 的被動(dòng)免疫功能在抑制有很大潛力, 這一潛力在開(kāi)發(fā)新型藥物和功能性食品中開(kāi)的結(jié)構(gòu)和功能

圖 2-2 pET28a(+)和 pCMV-tag2B 質(zhì)粒圖譜Fig.2-2 pET28a(+) and pcmv-tag2b plasmid.PCR 反應(yīng)體系配置如下組分 體積2×Taq Plus Master Mix 25 μL引物 Forward（10μM） 2.0 μL引物 Reverse（10μM） 2.0 μL模板 DNA 1.0 μLddH2O 20 μLTotal 50 μL按以上體系將各組分分別加入到 0.2 mL Ep 管中，用移液槍輕輕吹打混勻后入 PCR 儀，按以下程序設(shè)定反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2650776