【摘要】：[目的]通過(guò)DKK1干擾探討DKK1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨、成脂分化的調(diào)節(jié)作用,分析其調(diào)節(jié)機(jī)制。 [方法]1. Real time-PCR檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)早期Dkkl基因表達(dá)水平；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞激素作用下DKK1基因表達(dá)檢測(cè)。2.根據(jù)shRNA靶位點(diǎn)的選擇原則,從TRC shRNA數(shù)據(jù)庫(kù)及Ambion shRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中擇優(yōu)選取三條DKK1shRNA序列,通過(guò)DKK1構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,篩選出最佳干擾序列,體外同源重組構(gòu)建DKK1-shRNA腺病毒表達(dá)載體,經(jīng)酶切、PCR鑒定、測(cè)序。 3. rAd-EGFP轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞熒光表達(dá)觀察；腺病毒對(duì)細(xì)胞增殖影響分析；Ad-DKK1-shRNA轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后分別行成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),分別檢測(cè)其分化特異因子以及相關(guān)的特異蛋白的表達(dá)水平,分析其與對(duì)照組數(shù)據(jù)的差異性。并行組織染色觀察其形態(tài)學(xué)變化。 [結(jié)果]1.實(shí)驗(yàn)應(yīng)用real time-PCR檢測(cè)Dkkl基因在大鼠BMSCs成脂、成骨分化48小時(shí)內(nèi)的相對(duì)基因表達(dá)水平,通過(guò)目的基因的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線得出Ct值,經(jīng)內(nèi)參β-actin校正計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量ΔCt值,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)：成脂組與正常對(duì)照組,在成脂誘導(dǎo)6、12、24、48時(shí)dkkl基因表達(dá)水平較對(duì)照組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。成骨組與正常對(duì)照組,0.5、6兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)Dkkl基因表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞激素處理3、6、12、24時(shí),real time-pcr檢測(cè)DKK1基因表達(dá),結(jié)果顯示激素作用下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞DKK1表達(dá)明顯增加。2.成功構(gòu)建pYr-1.1-DKK1-shRNA-153、 pYr-1.1-DKK1-shRNA-155、pYr-1.1-DKK1-shRNA-Am表達(dá)載體,分別通過(guò)RT-PCR與Western blotting檢測(cè)DKK1的表達(dá),結(jié)果顯示pYr-1.1-DKK1-shRNA-153為最佳干擾序列。3.熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)情況顯示,MOI-10、20均可較高的轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,MOI-5、10、20、30、40、50pfu/cell在轉(zhuǎn)染后3天,對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響；sh-DKK1明顯抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化。sh-DKK1促進(jìn)成骨蛋白Osteocalcin表達(dá)和coll-I蛋白表達(dá)。 [結(jié)論]Dkkl在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂分化早期可能起重要的調(diào)節(jié)作用,激素可能通過(guò)調(diào)節(jié)DKK1的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)節(jié)成骨、成脂分化的作用DKK1干擾明顯抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期成脂分化,促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨蛋白表達(dá),促進(jìn)早期成骨分化。DKK1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨、成脂分化中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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2 張為新,梁益慧,鄧樹(shù)海;強(qiáng)力霉素緩釋給藥系統(tǒng)的體內(nèi)外藥物釋放[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2000年05期

3 孫蘭,邱明才,翁玲玲,鄭虎,劉景生;XW630對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2000年03期

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本文編號(hào)：2649608