【摘要】：[目的]通過DKK1干擾探討DKK1在骨髓間充質(zhì)干細胞早期成骨、成脂分化的調(diào)節(jié)作用,分析其調(diào)節(jié)機制。 [方法]1. Real time-PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細胞成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)早期Dkkl基因表達水平；骨髓間充質(zhì)干細胞激素作用下DKK1基因表達檢測。2.根據(jù)shRNA靶位點的選擇原則,從TRC shRNA數(shù)據(jù)庫及Ambion shRNA數(shù)據(jù)庫中擇優(yōu)選取三條DKK1shRNA序列,通過DKK1構(gòu)建過表達載體,篩選出最佳干擾序列,體外同源重組構(gòu)建DKK1-shRNA腺病毒表達載體,經(jīng)酶切、PCR鑒定、測序。 3. rAd-EGFP轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞熒光表達觀察；腺病毒對細胞增殖影響分析；Ad-DKK1-shRNA轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞,轉(zhuǎn)染后分別行成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),分別檢測其分化特異因子以及相關(guān)的特異蛋白的表達水平,分析其與對照組數(shù)據(jù)的差異性。并行組織染色觀察其形態(tài)學(xué)變化。 [結(jié)果]1.實驗應(yīng)用real time-PCR檢測Dkkl基因在大鼠BMSCs成脂、成骨分化48小時內(nèi)的相對基因表達水平,通過目的基因的擴增動力學(xué)曲線得出Ct值,經(jīng)內(nèi)參β-actin校正計算出目的基因的相對表達量ΔCt值,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗：成脂組與正常對照組,在成脂誘導(dǎo)6、12、24、48時dkkl基因表達水平較對照組增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。成骨組與正常對照組,0.5、6兩個時間點Dkkl基因表達量較對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。骨髓間充質(zhì)干細胞激素處理3、6、12、24時,real time-pcr檢測DKK1基因表達,結(jié)果顯示激素作用下,骨髓間充質(zhì)干細胞DKK1表達明顯增加。2.成功構(gòu)建pYr-1.1-DKK1-shRNA-153、 pYr-1.1-DKK1-shRNA-155、pYr-1.1-DKK1-shRNA-Am表達載體,分別通過RT-PCR與Western blotting檢測DKK1的表達,結(jié)果顯示pYr-1.1-DKK1-shRNA-153為最佳干擾序列。3.熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達情況顯示,MOI-10、20均可較高的轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞；腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞,MOI-5、10、20、30、40、50pfu/cell在轉(zhuǎn)染后3天,對細胞增殖無明顯影響；sh-DKK1明顯抑制骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化。sh-DKK1促進成骨蛋白Osteocalcin表達和coll-I蛋白表達。 [結(jié)論]Dkkl在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨、成脂分化早期可能起重要的調(diào)節(jié)作用,激素可能通過調(diào)節(jié)DKK1的表達而發(fā)揮調(diào)節(jié)成骨、成脂分化的作用DKK1干擾明顯抑制骨髓間充質(zhì)干細胞早期成脂分化,促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨蛋白表達,促進早期成骨分化。DKK1在骨髓間充質(zhì)干細胞早期成骨、成脂分化中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2649608