【摘要】：Ⅰ型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)是人群中常見的病毒,可引起人類多種疾病,已成為嚴(yán)重危害人類健康的重要病原之一,目前尚無有效的藥物和疫苗。HSV-1 UL2基因編碼的UL2蛋白是一種尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase,UDG),它能精確地從合成的DNA中切除錯誤摻入的尿嘧啶,這在病毒復(fù)制過程中的堿基修復(fù)中起著重要的作用。此外,雖然UL2對病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的復(fù)制不是必需的,但是對病毒在神經(jīng)元中的有效復(fù)制是必需的。因此,UL2在病毒的致病性、潛伏和再激活中可能發(fā)揮著重要作用。目前,關(guān)于HSV-1 UL2在病毒感染中的確切功能還不是很清楚。本研究中,為了分析UL2在活細(xì)胞中的分布情況,我們利用分子克隆技術(shù)首先將UL2的全長開放讀碼框與增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(Enhanced yellow fluorescence protein,EYFP)融合構(gòu)建相應(yīng)真核表達(dá)質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),在其它病毒蛋白不存在的情況下,UL2在活細(xì)胞內(nèi)主要定位在細(xì)胞核內(nèi),證實(shí)它是一個核靶向蛋白。通過構(gòu)建一系列與EYFP融合的UL2缺失或定點(diǎn)突變體表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后進(jìn)行熒光定位分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)UL2含有一個功能性的核輸入信號(Nuclear localization signal,NLS)(~1MKRACSRSPSPRRRPSS~(17)),它的關(guān)鍵氨基酸(Amino acids,aa)是~(12)RRR~(14)。同時,我們也證實(shí)預(yù)測的核輸出信號(Nuclear export signal,NES)不起作用。利用Ran-GTP、importinα/β顯性負(fù)突變體和抑制劑及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步研究顯示,UL2是在RanGTP提供能量情況下通過importinα1、α5、α7、β1和transportin-1多種受體介導(dǎo)的方式進(jìn)入細(xì)胞核。此外,異源核融合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了UL2是一種核質(zhì)穿梭蛋白。根據(jù)鑒定到的UL2 NLS及其關(guān)鍵aa,我們利用Red同源重組技術(shù)在含HSV-1BAC Luc的大腸桿菌GS1783中構(gòu)建了UL2 NLS突變型(UL2 NLSm)、UL2缺失型(?UL2)和UL2回復(fù)型(?UL2R)相關(guān)重組病毒的細(xì)菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome,BAC),并將它們轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后獲得相應(yīng)重組病毒。通過病毒滴度測定實(shí)驗(yàn)確定了獲得的重組病毒滴度,同時重組病毒的生長曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UL2的核輸入對病毒的有效復(fù)制是至關(guān)重要的,UL2缺失的病毒的復(fù)制減弱。因此,以上這些研究結(jié)果將為深入闡明UL2在HSV-1感染中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ),也為進(jìn)一步的抗病毒藥物靶點(diǎn)設(shè)計和疫苗研制提供理論依據(jù)。
【圖文】：

AHSV-1的結(jié)構(gòu)模式圖

衣殼和包膜之間蛋白區(qū)域組成的無規(guī)則結(jié)構(gòu)，稱為皮層。HSV-1 的基因組是一個大小約 150Kbp 的線性雙鏈 DNA 分子，其結(jié)構(gòu)由兩個共價連接的片段 L（長）和S（短片段）組成，兩側(cè)是反向重復(fù)序列IRL和TRL以及IRS和TRS（圖1-1B）。而衣殼呈二十面體立體對稱，由4種蛋白組成，它們分別是主要衣殼蛋白（VP5）、支架蛋白（pre-VP22a）、VP19C 和 VP23。HSV-1 的包膜含有大約 11 種病毒糖蛋白，，其中 4 種糖蛋白（gD、gH、gL 和 gB）是 HSV-1 進(jìn)入細(xì)胞所必需的。gC 和
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373.11

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 盧建紅;唐運(yùn)蓮;李桂源;;以BAC為基礎(chǔ)的皰疹病毒感染性克隆技術(shù)[J];中國生物工程雜志;2006年06期

本文編號：2647142