【摘要】：目的:探討胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)是否通過(guò)激活蛋白酶體相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(NF-E2-related factor 2)上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells,NSCs)蛋白酶體活性,進(jìn)而促進(jìn)NSCs增殖和分化,旨在尋求維持NSCs自我更新活力的有效靶點(diǎn),為治療神經(jīng)退行性疾病延緩衰老提供新思路。方法:1、分離培養(yǎng)新生(Postnatal day 0,P0)小鼠海馬NSCs,IGF-1作用24 h后,分析不同濃度IGF-1對(duì)NSCs蛋白酶體活性及其亞單位PSMB1,PSMB2,PSMB5,PSMA3的mRNA表達(dá)變化的影響。2、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和Tuj1免疫熒光染色檢測(cè)IGF-1對(duì)NSCs增殖分化潛能的影響。3、Nrf2免疫熒光染色檢測(cè)IGF-1干預(yù)NSCs后,蛋白酶體相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)變化。4、設(shè)計(jì)合成靶向Nrf2的siRNA序列及其對(duì)照negative control(NC)序列,電轉(zhuǎn)染NSCs,從mRNA和蛋白水平驗(yàn)證敲除效率。應(yīng)用IGF-1(100 ng/mL)作用于siRNA組和NC組NSCs,應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白酶體活性,BrdU和Tuj1免疫熒光染色、SA-β-gal染色以及CCK8實(shí)驗(yàn)分析IGF-1是否通過(guò)激活Nrf2影響NSCs蛋白酶體活性,進(jìn)而調(diào)控NSCs活力。結(jié)果:1、隨IGF-1濃度增加NSCs蛋白酶體活性增高,其中50 ng/m L和100 ng/m L IGF-1組NSCs蛋白酶體活性分別是PBS對(duì)照組1.75±0.26(P0.01)倍和2.02±0.19(P0.05)倍。IGF-1作用24 h后提取NSCs總RNA,Real-time PCR檢測(cè)蛋白酶體亞單位的表達(dá)變化,20、50、100 ng/m L IGF-1能夠使NSCs PSMA3的mRNA表達(dá)較PBS對(duì)照組升高1.11±0.02倍(P0.05)、1.16±0.03倍(P0.01)和1.17±0.03倍(P0.01)。此外,100 ng/m L IGF-1還能夠使NSCs PSMB5的mRNA表達(dá)水平增高1.18±0.04倍(P0.05)。2、BrdU免疫熒光染色結(jié)果顯示IGF-1作用24 h能夠提高NSCs增殖能力,50ng/m L組和100 ng/m L組BrdU陽(yáng)性率分別是37.83%±2.71%和39.36%±3.28%,顯著高于PBS對(duì)照組30.08%±2.42%(P0.05)。Tuj1免疫熒光染色結(jié)果也顯示,應(yīng)用50 ng/m L和100 ng/m L IGF-1作用于NSCs 3 d,Tuj1陽(yáng)性新生神經(jīng)元數(shù)量分別是34.32%±3.04%和47.27%±3.37%,顯著高于PBS對(duì)照組20.22%±1.92%(P0.05),提示IGF-1能夠促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化。3、IGF-1干預(yù)NSCs 24 h,Nrf2免疫熒光染色顯示IGF-1組細(xì)胞核熒光信號(hào)增強(qiáng)。MetaMorph分析軟件表明隨IGF-1濃度增高,Nrf2熒光信號(hào)細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比值(核/質(zhì)比)逐漸增高,20 ng/mL,50 ng/m L和100 ng/m L組分別是PBS對(duì)照組的1.32±0.12倍,1.41±0.11倍和1.52±0.21倍(P0.05)。結(jié)果提示IGF-1能夠促進(jìn)蛋白酶體相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)錄激活。4、NSCs電轉(zhuǎn)染靶向Nrf2的siRNA序列,western blot結(jié)果顯示siRNA干擾效率為34.28%±7.28%(P0.01)。應(yīng)用100 ng/mL IGF-1作用于siRNA組和NC對(duì)照組24 h后,siRNA組蛋白酶體活性較NC組降低0.37±0.04(P0.001)。此外IGF-1干預(yù)后siRNA組NSCs增殖能力和Tuj1陽(yáng)性率也分別較NC組下降6.24%±0.83%(P0.05)和6.34%±1.05%(P0.05),細(xì)胞活力下降0.83±0.07(P0.001),衰老細(xì)胞陽(yáng)性率增加12.39%±1.37%(P0.05)。提示在IGF-1可能通過(guò)激活Nrf2上調(diào)NSCs蛋白酶體活性,進(jìn)而提高細(xì)胞活力。結(jié)論:1、IGF-1可以提高NSCs的蛋白酶體活性,促進(jìn)NSCs增殖分化,維持細(xì)胞自我更新。2、IGF-1可能通過(guò)激活Nrf2上調(diào)NSCs蛋白酶體活性,進(jìn)而提高細(xì)胞活力。
【圖文】：

蛋白酶體活性

BrdU陽(yáng)性率
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R338

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2647251