發(fā)布時間：2020-05-02 16:16

【摘要】：目的:探討胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)是否通過激活蛋白酶體相關核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(NF-E2-related factor 2)上調(diào)神經(jīng)干細胞(Neural Stem Cells,NSCs)蛋白酶體活性,進而促進NSCs增殖和分化,旨在尋求維持NSCs自我更新活力的有效靶點,為治療神經(jīng)退行性疾病延緩衰老提供新思路。方法:1、分離培養(yǎng)新生(Postnatal day 0,P0)小鼠海馬NSCs,IGF-1作用24 h后,分析不同濃度IGF-1對NSCs蛋白酶體活性及其亞單位PSMB1,PSMB2,PSMB5,PSMA3的mRNA表達變化的影響。2、BrdU摻入實驗和Tuj1免疫熒光染色檢測IGF-1對NSCs增殖分化潛能的影響。3、Nrf2免疫熒光染色檢測IGF-1干預NSCs后,蛋白酶體相關核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達變化。4、設計合成靶向Nrf2的siRNA序列及其對照negative control(NC)序列,電轉(zhuǎn)染NSCs,從mRNA和蛋白水平驗證敲除效率。應用IGF-1(100 ng/mL)作用于siRNA組和NC組NSCs,應用熒光酶標儀檢測蛋白酶體活性,BrdU和Tuj1免疫熒光染色、SA-β-gal染色以及CCK8實驗分析IGF-1是否通過激活Nrf2影響NSCs蛋白酶體活性,進而調(diào)控NSCs活力。結果:1、隨IGF-1濃度增加NSCs蛋白酶體活性增高,其中50 ng/m L和100 ng/m L IGF-1組NSCs蛋白酶體活性分別是PBS對照組1.75±0.26(P0.01)倍和2.02±0.19(P0.05)倍。IGF-1作用24 h后提取NSCs總RNA,Real-time PCR檢測蛋白酶體亞單位的表達變化,20、50、100 ng/m L IGF-1能夠使NSCs PSMA3的mRNA表達較PBS對照組升高1.11±0.02倍(P0.05)、1.16±0.03倍(P0.01)和1.17±0.03倍(P0.01)。此外,100 ng/m L IGF-1還能夠使NSCs PSMB5的mRNA表達水平增高1.18±0.04倍(P0.05)。2、BrdU免疫熒光染色結果顯示IGF-1作用24 h能夠提高NSCs增殖能力,50ng/m L組和100 ng/m L組BrdU陽性率分別是37.83%±2.71%和39.36%±3.28%,顯著高于PBS對照組30.08%±2.42%(P0.05)。Tuj1免疫熒光染色結果也顯示,應用50 ng/m L和100 ng/m L IGF-1作用于NSCs 3 d,Tuj1陽性新生神經(jīng)元數(shù)量分別是34.32%±3.04%和47.27%±3.37%,顯著高于PBS對照組20.22%±1.92%(P0.05),提示IGF-1能夠促進NSCs向神經(jīng)元方向分化。3、IGF-1干預NSCs 24 h,Nrf2免疫熒光染色顯示IGF-1組細胞核熒光信號增強。MetaMorph分析軟件表明隨IGF-1濃度增高,Nrf2熒光信號細胞核/細胞質(zhì)比值(核/質(zhì)比)逐漸增高,20 ng/mL,50 ng/m L和100 ng/m L組分別是PBS對照組的1.32±0.12倍,1.41±0.11倍和1.52±0.21倍(P0.05)。結果提示IGF-1能夠促進蛋白酶體相關核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)錄激活。4、NSCs電轉(zhuǎn)染靶向Nrf2的siRNA序列,western blot結果顯示siRNA干擾效率為34.28%±7.28%(P0.01)。應用100 ng/mL IGF-1作用于siRNA組和NC對照組24 h后,siRNA組蛋白酶體活性較NC組降低0.37±0.04(P0.001)。此外IGF-1干預后siRNA組NSCs增殖能力和Tuj1陽性率也分別較NC組下降6.24%±0.83%(P0.05)和6.34%±1.05%(P0.05),細胞活力下降0.83±0.07(P0.001),衰老細胞陽性率增加12.39%±1.37%(P0.05)。提示在IGF-1可能通過激活Nrf2上調(diào)NSCs蛋白酶體活性,進而提高細胞活力。結論:1、IGF-1可以提高NSCs的蛋白酶體活性,促進NSCs增殖分化,維持細胞自我更新。2、IGF-1可能通過激活Nrf2上調(diào)NSCs蛋白酶體活性,進而提高細胞活力。
【圖文】：

蛋白酶體活性

BrdU陽性率
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R338

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

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2 Tian Lei;Xie Ling;;IGF-1 promotes the growth and metastasis of hepatocellular carcinoma via the inhibition of proteasome-mediated cathepsin B degradation[J];World Journal of Gastroenterology;2015年35期

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相關碩士學位論文 前1條

1 張凝宇;多發(fā)性骨髓瘤微小RNA基因序列突變的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

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本文編號：2647251