【摘要】：目的:基于mi RNA122對含有靶序列基因的調(diào)節(jié)功能,通過應(yīng)用內(nèi)源mi RNA對轉(zhuǎn)基因表達的負向調(diào)控作用,減少目的基因-天花粉蛋白載體中轉(zhuǎn)基因片段的異位表達,構(gòu)建細胞毒性基因r AAV載體的包裝系統(tǒng)。方法:(1)質(zhì)粒構(gòu)建:首先,利用分子組裝技術(shù)將基因片段嵌入由雞β-肌動蛋白啟動子及巨細胞病毒增強子(CBAp)驅(qū)動的質(zhì)粒中,并將插入位點定位于兩個末端重復(fù)序列(ITR)之間,獲得一系列用于r AAV制備的目的基因載體。(2)細胞轉(zhuǎn)染:然后將目的基因構(gòu)建到腺相關(guān)病毒載體,將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細胞中,檢測目的蛋白的表達。(3)雙報告基因檢測:通過Gaussia Luciferase和Firefly Luciferase報告基因檢測,測得報告基因的表達水平,并建立表達mi R122水平更高的細胞株,以增強對mir122T上游基因的調(diào)控能力。(4)重組腺相關(guān)病毒的包裝及純化:運用q PCR,Western Blot等技術(shù)比較原細胞株與新細胞株的一系列生物特性,以檢測用于包裝r AAV的可行性。結(jié)果:內(nèi)源性和外源性mi R-122具有組織特異性,并可對靶序列基因的表達進行調(diào)控;分選獲得過表達mi R-122和GLuc的HEK293-mir122-GLuc細胞株,mir122抑制靶序列的表達的作用同樣適用于HEK293-mir122-GLuc細胞株,并且在生長速度與轉(zhuǎn)染效率上都優(yōu)于原有HEK293細胞;并將mir122T序列插入細胞毒性基因表達框的3’端非編碼區(qū)域以降低工程細胞內(nèi)毒性基因的表達水平,最終應(yīng)用該病毒包裝系統(tǒng)進行了細胞毒性基因的r AAV載體的制備及感染。結(jié)論:細胞毒性基因-天花粉蛋白的重組腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建成功。
【圖文】：

6圖 1 所示，通過 PCR 及化學(xué)合成的方法獲取目的基因片段后，利用分，將基因片段嵌入由雞β-肌動蛋白啟動子及巨細胞病毒增強子（CBA粒中，并將插入位點定位于兩個末端重復(fù)序列（ITR）之間，獲得一系V制備的目的基因載體。于本實驗室前期研究[22]，CBAp 啟動子元件可持續(xù)穩(wěn)定表達外源目的基研究目的基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄條件下，miR122 及其靶序列的相互作用對基后調(diào)控對目的基因表達的影響。據(jù)此，我們將 miR122 及 5 個與 miR1的串聯(lián)靶序列單元（miR122T 5x）分別插入 GLUC 基因上游（A）及 3’端非翻譯區(qū)域（B），通過建立熒光素酶報告系統(tǒng)，用于驗證該表達否完整；并將編碼天花粉蛋白（E,F）及白喉毒素（圖略）的基因嵌入

圖 2 各實驗組中 Gaussia 及 Firefly 兩種熒光素酶的表達水平注：采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證 miR122 能夠抑制攜有 miR122 靶位點載體目的基因的表達。2.2 內(nèi)源性 miR122 具有組織特異性，并可對靶序列基因的表達進行調(diào)
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R346

【參考文獻】

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1 Chen Ling;Yuan Wang;Ying-lu Feng;Ya-ni Zhang;Jun Li;Xin-rui Hu;Li-na Wang;Mao-feng Zhong;Xiao-feng Zhai;Irene Zolotukhin;Arun Srivastava;Chang-quan Ling;;Prevalence of neutralizing antibodies against liver-tropic adeno-associated virus serotype vectors in 100 healthy Chinese and its potential relation to body constitutions[J];Journal of Integrative Medicine;2015年05期

2 Yuan-hui Zhang;Yuan Wang;Ali Hussein Yusufali;Frederick Ashby;Daniel Zhang;Zi-fei Yin;George V.Aslanidi;Arun Srivastava;Chang-quan Ling;Chen Ling;;Cytotoxic genes from traditional Chinese medicine inhibit tumor growth both in vitro and in vivo[J];Journal of Integrative Medicine;2014年06期

3 Chang-quan Ling;Xiao-qiang Yue;Chen Ling;;Three advantages of using traditional Chinese medicine to prevent and treat tumor[J];Journal of Integrative Medicine;2014年04期

4 Chang-quan Ling;Li-na Wang;Yuan Wang;Yuan-hui Zhang;Zi-fei Yin;Meng Wang;Chen Ling;;The roles of traditional Chinese medicine in gene therapy[J];Journal of Integrative Medicine;2014年02期

5 Li-na Wang;Yuan Wang;Yuan Lu;Zi-fei Yin;Yuan-hui Zhang;George V.Aslanidi;Arun Srivastava;Chang-quan Ling;Chen Ling;;Pristimerin enhances recombinant adeno-associated virus vector-mediated transgene expression in human cell lines in vitro and murine hepatocytes in vivo[J];Journal of Integrative Medicine;2014年01期

6 劉志斌;王新;劉會娟;金艷濤;郭會軍;蔣自強;李真;徐立然;;Treatment of Acquired Immunodeficiency Syndrome with Chinese Medicine in China:Opportunity,Advancement and Challenges[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2013年08期

7 張帆;胡向兵;曹榮月;朱學(xué)軍;劉景晶;;天花粉蛋白抗小鼠H22腫瘤作用的研究[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報;2011年03期

8 唐文皓,吳志全,樊嘉,陳軍;天花粉蛋白對荷人肝癌裸小鼠的抑癌作用[J];中華肝膽外科雜志;2003年04期

9 程繼華,彭吉潤,曹宗獻,張佑彬,冷希圣,杜如昱;肝癌特異性p53基因腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[J];中華普通外科雜志;2001年06期

10 吳桂臣;旁觀者效應(yīng)的機制及加強措施[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);1998年04期

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本文編號：2646975