發(fā)布時間：2020-05-01 12:01

【摘要】：A型流感病毒可引起人和動物急性上呼吸道感染，會導(dǎo)致一些免疫力較弱或者免疫失調(diào)的感染者患上嚴(yán)重并發(fā)癥，如肺炎或心臟衰竭，導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。A型流感病毒還能夠引起全球性大流行，致上千萬人死亡，造成人們心理恐慌，增加社會不穩(wěn)定因素和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于流感病毒變異性高、宿主廣泛、傳播途徑多樣，目前流感疫情防控形勢嚴(yán)峻。 流感疫苗是一種有效防治流感病毒的措施，不過針對流行毒株的疫苗開發(fā)具有明顯滯后性�？共《舅幬锸亲钃袅鞲胁《镜牡谝坏婪谰�。臨床使用藥物都已發(fā)現(xiàn)有耐藥性問題，開發(fā)新型抗流感病毒藥物需求與日俱增。通過基因沉默技術(shù)抑制病毒復(fù)制相關(guān)宿主靶標(biāo)以達(dá)到阻斷病毒復(fù)制的策略，能夠?qū)崿F(xiàn)廣譜抗病毒，并且減輕病毒耐藥性產(chǎn)生。 在前期工作中，通過蛋白組學(xué)方法證實(shí)了促凋亡蛋白PDCD5（programmedcell death protein5）參與流感病毒RNA合成，靶向PDCD5的硫代反義寡核苷酸（PS-ASODN） prop5體外具有明顯抗流感病毒活性。本文旨在進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證prop5抗流感病毒活性并研究prop5抗流感病毒活性的機(jī)制。 體內(nèi)抗病毒活性研究表明，在感染流感病毒前30min和24h兩次滴鼻給藥prop5（10和20mg/kg/d）能夠顯著提高感染小鼠存活率（P 0.01），延長平均存活天數(shù)（P 0.01），減輕感染小鼠體重下降。在病毒感染后第2、4和6天，prop5（10和20mg/kg/d）預(yù)處理小鼠病毒滴度與未給藥小鼠相比顯著下降（P 0.05和P 0.01）。prop5（20mg/kg/d）預(yù)處理小鼠在感染第6天小鼠肺指數(shù)顯著下降（P 0.05）。此外，prop5能夠抑制流感病毒感染小鼠肺組織內(nèi)的細(xì)胞凋亡。 在確定prop5體內(nèi)外具有顯著抗流感病毒活性基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其抗流感病毒機(jī)制。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明prop5能夠抑制其目的蛋白PDCD5表達(dá)，同時也能夠抑制流感病毒感染后所誘導(dǎo)PDCD5的過量表達(dá)。通過TUNEL染色證明prop5能夠在體內(nèi)外抑制流感病毒引起的細(xì)胞凋亡。western blot分析證明prop5在感染小鼠中抑制Bax表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。并且prop5能夠抑制凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3活性和標(biāo)志性蛋白PARP的剪切。體外實(shí)驗(yàn)研究表明prop5抑制流感病毒感染細(xì)胞，通過溶血抑制試驗(yàn)和間接免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)prop5抑制了流感病毒介導(dǎo)的膜融合，干擾病毒遺傳物質(zhì)釋放到細(xì)胞內(nèi)。prop5這種抑制膜融合的活性與其雙親性的特性和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。prop5進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)能夠抑制流感病毒的復(fù)制，通過免疫熒光技術(shù)和western blot證實(shí)prop5阻斷了病毒核糖核蛋白復(fù)合體（RNPs）從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)的過程。 綜上所述，prop5在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的抗流感病毒活性，為新型抗流感病毒藥物提供候選核酸藥物，為深入研究流感病毒-宿主相互關(guān)系提供新的研究視角。 腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）是一種重要的嗜神經(jīng)性腸道病毒，是引起手足口病的主要病原之一。在嚴(yán)重的病理?xiàng)l件情況下，EV71引起的相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括腦炎、無菌性腦膜炎、運(yùn)動神經(jīng)元死亡和腦干腦炎。EV71感染導(dǎo)致的肺水腫和心肺衰竭是EV71高致死率的主要原因。 本實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了EV71BrCr株10個蛋白的誘餌載體采用酵母雙雜交在成人腦cDNA文庫中篩選獲得35對病毒蛋白-宿主蛋白相互作用關(guān)系，捕獲29個宿主蛋白。其中18個蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)域定位在生物膜系統(tǒng)上，主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)運(yùn)輸、凋亡調(diào)控等功能。文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)其中的14蛋白已經(jīng)通過Y2H或/和免疫共沉淀等方式證實(shí)同其他病毒蛋白產(chǎn)生相互作用。對其中一對相互作用即ATP6V0C蛋白-病毒3A蛋白相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證，，采用免疫共沉淀和熒光雙標(biāo)技術(shù)證實(shí)它們能夠相互作用并且共定位于細(xì)胞質(zhì)。初步確定ATP6V0C參與病毒生活周期�？傊�，以上工作為研究EV71感染腦細(xì)胞機(jī)制和篩選抗EV71宿主靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

第 2 章 prop5 抗流感病毒活性及其機(jī)制研究結(jié)果p5 減少流感病毒感染小鼠死亡率和體重下降檢測 prop5 抗流感病毒活性的體內(nèi)活性，我們采用了小鼠適應(yīng)株1/47（H1N1）病感染 BALB/c 小鼠模型。prop5 分為 3 個劑量（/kg/d），隨機(jī)序列 prop5R（20 mg/kg/d）作為陰性對照，感染后結(jié)果表明，prop5（20 mg/kg/d 和 10 mg/kg/d）兩組的 10 只小鼠下來，prop5（5 mg/kg/d）組有 8 只小鼠存活。相反，陰性對照kg/d）組與病毒感染對照組小鼠全部死亡。prop5 處理的小鼠比和陰性對照 prop5R 組表現(xiàn)出更少的感染癥狀（圖 2-1A）。并且病毒感染小鼠平均體重下降且呈劑量依賴性（圖 2-1B）。

注：與病毒感染組對照相比，** P ＜ 0.01； x ± s，n = 3圖 2-2 prop5 減少感染小鼠肺部組織流感病毒 RNA 拷貝數(shù)Figure 2-2 Reduction of influenza virus RNA copies by prop5 in infected mice lung tissue1.4.3 prop5 降低感染小鼠肺組織 PDCD5 的表達(dá)通過熒光定量 RT-PCR 檢測 PDCD5 mRNA 在小鼠肺組織表達(dá)水平。結(jié)果 2-3A 所示，與流感病毒感染小鼠相比，prop5（10 和 20 mg/kg/d）處理的感鼠 PDCD5 的 mRNA 的表達(dá)水平顯著降低（兩者 P < 0.05）。進(jìn)一步檢測 PDC白在 prop5 處理的 mock-感染和流感病毒感染小鼠肺組織中的表達(dá)水平情況ALB/c 小鼠在 prop5 處理后滴鼻生理鹽水（mock-感染）或者感染流感病/FM/1/47（H1N1），在 1、3 和 6 d.p.i.，分別收集 mock-對照小鼠和流感病毒小鼠肺組織樣品。通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測 PDCD5 的表達(dá)情況，結(jié)果證op5 抑制 mock-對照小鼠肺組織 PDCD5 蛋白表達(dá)（圖 2-3B 左）；同時在流感感染小鼠肺組織中，prop5 以劑量依賴性方式抑制病毒感染引起的 PDCD5 的過量表達(dá)（圖 2-3B 右）。
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.13

【參考文獻(xiàn)】

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1 Kazuyoshi Kuwano;;Epithelial Cell Apoptosis and Lung Remodeling[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年06期

本文編號：2646622