【摘要】：研究背景 巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)屬β皰疹病毒亞科,其中感染人類(lèi)的是人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV),在人群中普遍感染。人群感染HCMV后通常呈潛伏感染,對(duì)健康人體并沒(méi)有明顯短期危害,但對(duì)免疫功能低下的個(gè)體,如艾滋病患者、器官移植患者、干細(xì)胞治療患者、腫瘤患者及使用免疫抑制劑的患者可造成致死性損傷¨。對(duì)嬰幼兒而言,HCMV是最常見(jiàn)的先天性感染病毒,是引起人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要病原之一,可導(dǎo)致胎兒畸形及遲發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等。此外HCMV長(zhǎng)期反復(fù)激活感染也引發(fā)一些慢性疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化等。 現(xiàn)代病毒學(xué)認(rèn)為程序性細(xì)胞死亡即是病毒感染導(dǎo)致機(jī)體損傷機(jī)制又是宿主本身一種抗病毒機(jī)制,宿主可通過(guò)程序性細(xì)胞死亡可以清除病毒感染的細(xì)胞,抑制病毒復(fù)制。很多針對(duì)病毒感染的治療,包括化療以及免疫治療均通過(guò)誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞死亡而實(shí)現(xiàn)。程序性細(xì)胞死亡主要分為兩種,I型為細(xì)胞凋亡(apoptosis),Ⅱ型是自噬性細(xì)胞死亡(autophagy)。過(guò)去關(guān)于細(xì)胞凋亡機(jī)制和信號(hào)傳遞的研究幫助我們對(duì)病毒感染致病的生物學(xué)特性有了一定的了解,并且在治療新策略方面為我們提供了一些潛在的分子靶點(diǎn)。相反,其它形式的程序性細(xì)胞死亡在病毒致病性中的作用卻研究較少。 研究目的 在此項(xiàng)研究中,我們將著力于掌握細(xì)胞自噬及其mTOR信號(hào)通路在HCMV感染過(guò)程中的作用。本項(xiàng)目研究的具體目的如下： 1.掌握HCMV感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬及其mTOR信號(hào)通路表達(dá)變化； 2.掌握細(xì)胞自噬及其mTOR信號(hào)通路在HCMV感染復(fù)制過(guò)程中的作用及其機(jī)制。 研究方法 1.檢測(cè)HCMV感染不同時(shí)期誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)以及nTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子及其下游蛋白的表達(dá)水平 將HCMV以MOI為1接種HELF細(xì)胞(人胚肺成纖維細(xì)胞),設(shè)立滅活病毒對(duì)照組,作用1h、2h、4h、8h、24h、2d、4d、8d后分別作如下檢測(cè)： 1.1自噬通過(guò)以下方法檢測(cè)：電子顯微鏡檢測(cè)自噬性細(xì)胞死亡形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、吖啶橙細(xì)胞染色熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬、流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)吖啶橙熒光顆粒陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、構(gòu)建自噬標(biāo)記物pGFP-LC3轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞,經(jīng)不同組HCMV感染后激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬激活、Western檢測(cè)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3表達(dá)。 1.2mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)水平檢測(cè)：Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子p-p70S6K(磷酸化的p70S6K)、 P-4E-BP1(磷酸化的4E-BP1)表達(dá)水平。 2.通過(guò)對(duì)使用自噬抑制劑、促進(jìn)劑作用后不同時(shí)間點(diǎn)的病毒感染、復(fù)制、釋放動(dòng)力學(xué)檢測(cè),判斷宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)對(duì)病毒增殖復(fù)制過(guò)程中的影響。 事先分別用自噬抑制劑3-MA及自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素用于HELF細(xì)胞,然后將HCMV以MOI為1分別接種HELF細(xì)胞(人胚肺成纖維細(xì)胞),設(shè)立滅活病毒對(duì)照組,作用12h、24h、36h、48h、60h。 2.1病毒增殖動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：收集細(xì)胞培養(yǎng)物和上清,凍融三次后,空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。 2.2病毒特異性蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)病毒特異性蛋白表達(dá)變化。 2.3病毒基因拷貝數(shù)檢測(cè)：熒光定量PCR檢測(cè)。 3.建立巨細(xì)胞病毒感染動(dòng)物模型技術(shù),在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證巨細(xì)胞病毒感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)改變。 BALB/c小鼠經(jīng)腹腔接種小鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV),建立小鼠巨細(xì)胞病毒感染小鼠模型,通過(guò)病毒分離、免疫熒光和PCR技術(shù)檢測(cè)模型小鼠感染狀態(tài),通過(guò)Western Blot檢測(cè)細(xì)胞自噬關(guān)籬蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表達(dá)水平和透射電鏡檢測(cè)檢測(cè)模型小鼠肺組織細(xì)胞自噬。 研究結(jié)果 1.吖啶橙染色、轉(zhuǎn)染GFP-LC3熒光顯微鏡觀察和透射電鏡觀察結(jié)果表明HCMV感染12h可明顯促進(jìn)HELF細(xì)胞自噬,HCMV感染36h后轉(zhuǎn)變?yōu)橐种艸ELF細(xì)胞自噬。免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HCMV感染12h抑制mTOR自噬信號(hào)通路下游關(guān)鍵分子表達(dá),感染36h后轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)mTOR信號(hào)通路下游關(guān)鍵分子表達(dá)。 2.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素組HCMV AD169株病毒DNA拷貝數(shù)、HCMV pp65蛋白表達(dá)量及病毒滴度均較正常對(duì)照組高,而自噬抑制劑3-MA組HCMV AD169株病毒DNA拷貝數(shù)、HCMV pp65蛋白表達(dá)量及病毒滴度均較正常對(duì)照組低。 3.在建立MCMV急性感染小鼠肺組織模型基礎(chǔ)上,透射電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示,MCMV感染組小鼠肺組織可看見(jiàn)明顯細(xì)胞自噬改變；Western檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,MCMV感染組LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào),結(jié)果表明MCMV急性感染促進(jìn)小鼠肺組織細(xì)胞自噬。 結(jié)論 1.本研究發(fā)現(xiàn)HCMV感染早期促進(jìn)宿主細(xì)胞白噬,感染晚期變?yōu)橐种扑拗骷?xì)胞自噬,而mTOR自噬信號(hào)通路參與其中。 2.本研究分別從分子、蛋白和細(xì)胞水平證實(shí)了促進(jìn)宿主細(xì)胞自噬可從一定程度上促進(jìn)HCMV增殖,抑制宿主細(xì)胞自噬可從一定程度上抑制HCMV增殖。 3. MCMV急性感染促進(jìn)小鼠肺組織細(xì)胞自噬。
【圖文】：

HBHH圖1 >>丫咬dト舊鄄煜赴訮瘧浠疉:對(duì)照細(xì)胞;B: HCMV感染HELF細(xì)胞12h結(jié)果；C; HCMV感染HELF細(xì)胞24h結(jié)果；D: HCMV感染HELF細(xì)胞36h結(jié)果；E; HCMV感染HELF細(xì)胞48h結(jié)果；F: HCMV感染HELF細(xì)胞60h結(jié)果Fig. 1 Acridine orange staining for autophagyA: control cells; B:HELF cells infected with HCMV for 12h;C:HELF cells infected with HCMV for 24h; D:HELF cells infected with HCMV for 36h;E: HELF cells infected with HCMV for 48h; F:HELF cells infected with HCMV for 60h1.2.2 n丫徒澄染色后流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞自唾泡進(jìn)行定量檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HELF細(xì)胞制成細(xì)胞懸液移至到6孔培養(yǎng)板中，附壁后當(dāng)細(xì)胞于6孔板生長(zhǎng)匯合至70%?80%時(shí)，然后將HCMV以MOI為1接種HELF細(xì)胞，，分別作用12h、24h、36h、48h、60h,，收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀刮下來(lái)，吹勻，形成單細(xì)胞懸液。B丫晾橙用PBS稀釋為終濃度0.5ug/ml，室溫下避光染色15min，離心棄染液，再用PBS洗3次

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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王昕榮,陳素華,劉海智,熊錦文,凌霞珍;豚鼠胎仔腎臟巨細(xì)胞病毒感染的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2004年02期

2 熊錦文,陳素華,聞良珍,邢瑋,凌霞珍;套式聚合酶鏈反應(yīng)在豚鼠巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染模型中的應(yīng)用價(jià)值[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2004年05期

本文編號(hào)：2641443