【摘要】：第一部分:LPS刺激下RAW264.7細胞中SMAC、c IAP1、TRAF3水平以及MAPK信號通路的變化目的:觀察LPS刺激下,RAW264.7巨噬細胞中SMAC、TRAF3及c IAP1蛋白表達變化,并探討對細胞MAPK信號通路的影響。方法:用100 ug/ml的LPS分別處理RAW264.7細胞0 h、1 h、2 h以及4 h后收集細胞。Western blot檢測各組細胞中SMAC、c IAP1、TRAF3以及與MAPK通路密切相關的p-JNK和p-p38的蛋白表達;細胞免疫熒光技術進一步檢測細胞中SMAC的蛋白表達;q RT-PCR檢測細胞炎癥因子TNF-α和IL-1的核酸表達。結果:(1)隨著LPS處理時間的延長,細胞中SMAC和TRAF3的表達逐漸降低,c IAP1的表達逐漸升高。和LPS處理0 h相比,處理1 h、2 h、4 h后細胞中SAMC、c IAP1以及TRAF3的蛋白表達差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);SMAC的免疫熒光結果與Western blot結果基本一致;(2)p-JNK和p-p38的蛋白表達也隨著LPS處理時間延長而逐漸升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);(3)TNF-α和IL-1的核酸表達隨著LPS的處理時間延長,表達逐漸升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:在體外,LPS抑制RAW264.7巨噬細胞SMAC和TRAF3的表達,促進c IAP1的表達,并通過激活MAPK信號通路,進一步活化巨噬細胞,誘導炎癥因子的釋放。第二部分:Birinapant對LPS誘導的RAW264.7細胞活化的影響及機制研究目的:探討SMAC類似物Birinapant對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞活化的影響及其分子機制。方法:用300 nmol/ml的Birinapant預處理RAW264.7巨噬細胞后,再用100ug/ml LPS刺激巨噬細胞的方式進行建模。將實驗分為四組:(1)不做任何處理的空白對照組(Blank);(2)Birinapant預處理+LPS組(Birinapant);(3)只用LPS處理組(Vehicle);(4)只用Birinapant預處理不加LPS處理的對照組(Control)。Birinapant處理時間為24 h,LPS處理時間為4 h,收集各組細胞。Western blot檢測各組細胞中c IAP1、TRAF3以及MAPK通路蛋白的表達;免疫共沉淀技術(Co-IP)檢測TRAF3和K48泛素化的關系以及檢測Birinapant組和Vehicle組TRAF3的K48泛素化水平;q RT-PCR檢測細胞炎癥因子TNF-α和IL-1的核酸表達。結果:(1)和Blank組相比,Vehicle組中c IAP1的蛋白表達升高,TRAF3的蛋白表達降低,此結果和第一部分研究結果一致;Birinapant組和Vehicle組相比,Birinapant組c IAP1的表達顯著降低,TRAF3表達顯著升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Control組中TRAF3和c IAP1的表達沒有顯著變化,無統(tǒng)計學差異(P0.05);(2)TRAF3和K48泛素化直接作用,與Vehicle組相比,Birinapant組TRAF3的K48泛素化水平明顯降低;(3)Vehicle組中p-JNK和p-p38的蛋白表達較高,Birinapant組與Vehicle組相比p-JNK和p-p38的蛋白表達均顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);單獨使用Birinapant(Control組)不會促進或者抑制JNK和p38的磷酸化(P0.05);(4)Vehicle組TNF-α以及IL-1的m RNA相對表達量較高,與實驗第一部分結果一致,加入Birinapant預處理后(Birinapant組),明顯抑制了LPS介導的相關炎癥因子表達,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:SMAC類似物Birinapant在體外通過抑制細胞c IAP1的表達,抑制TRAF3的K48泛素化,從而抑制TRAF3的降解,進而通過抑制MAPK信號通路的激活有效抑制LPS介導的巨噬細胞活化,減少促炎因子的產(chǎn)生。第三部分:LPS刺激下小鼠KCs中SMAC、c IAP1、TRAF3的水平以及MAPK信號通路的變化目的:探討LPS刺激下,活體小鼠肝臟Kupffer細胞(KCs)中SMAC、c IAP1、TRAF3的水平變化以及對MAPK信號通路的影響,并觀察LPS對小鼠肝臟損傷、肝功能以及小鼠生存率的影響。方法:(1)用腹腔注射LPS(10 mg/kg)的方式構建小鼠肝損傷模型,每組4只小鼠,每組分別處理0 h,6 h,12 h,24 h后,取下各組小鼠肝臟以及提取肝臟KCs。F4/80免疫熒光染色法鑒定KCs的純度;臺盼藍染色法和吞墨實驗分析KCs的活力及吞噬能力;Western blot檢測各組KCs中SMAC、c IAP1、TRAF3以及與MAPK通路密切相關的p-JNK和p-p38蛋白表達;ELISA檢測血清中TNF-α和IL-1的水平;血生化檢測與肝功能密切相關的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TBil)的含量;HE染色法測定肝臟組織的損傷程度;(2)取24只8周大的小鼠,隨機均分為兩組,一組用腹腔注射致死劑量LPS(45 mg/kg)的方式構建小鼠膿毒血癥模型,另一組用等量生理鹽水腹腔注射,Kaplan-Meier法進行小鼠生存分析。結果:(1)F4/80免疫熒光染色法測得KCs純度為78.57%;臺盼藍染色法顯示KCs活力在80%以上;吞墨實驗可見KCs吞噬大量碳素顆粒;(2)隨著腹腔注射LPS處理時間的延長,KCs中SMAC和TRAF3的表達逐漸降低,c IAP1的表達逐漸升高,和LPS處理0 h相比,處理6 h、12 h、24 h后上述蛋白表達差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);(3)隨著LPS處理時間的延長,p-JNK和p-p38的蛋白表達逐漸升高;血生化和ELISA檢測顯示,LPS刺激下小鼠血清中TNF-α、IL-1、ALT、AST以及TBil的含量明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);(4)HE染色結果顯示LPS誘導小鼠肝臟損傷;(5)實驗組(LPS致死劑量組)小鼠中位生存期為36.0 h,72 h的存活率僅為16.7%,對照組(注射等量生理鹽水)所有小鼠在觀察時間內(nèi)未出現(xiàn)死亡。結論:(1)在體內(nèi),LPS抑制KCs中SMAC和TRAF3的表達,促進c IAP1的表達,并通過激活MAPK信號通路促進炎癥因子的釋放,誘導肝臟損傷及肝功能異常;(2)致死劑量LPS可以顯著縮短小鼠生存時間。第四部分:Birinapant對LPS誘導的KCs活化、小鼠肝損傷以及小鼠生存率的影響及其分子機制目的:探討SMAC類似物Birinapant對LPS誘導的KCs活化、小鼠肝損傷和小鼠生存率的影響及其分子機制。方法:(1)將實驗分為兩個大組,每大組各20只小鼠:(1)實驗組(Birinapant)小鼠預先用Birinapant(30 mg/kg)腹腔注射處理;(2)對照組(Vehicle)小鼠用等量生理鹽水腹腔注射。兩組小鼠在喂養(yǎng)24 h后,再將兩大組小鼠分別分為五小組,每小組4只小鼠,均以腹腔注射LPS(10 mg/kg)的方式構建動物模型,LPS的處理時間分別為0 h,1 h,3 h,6 h和12 h。Western blot檢測各組KCs中c IAP1、TRAF3以及與MAPK通路密切相關的p-JNK和p-p38蛋白表達;免疫共沉淀技術檢測Birinapant組和Vehicle組TRAF3的K48泛素化水平;免疫組化檢測肝臟組織中TRAF3和c IAP1的蛋白表達;ELISA檢測血清中TNF-α和IL-1的水平;血生化檢測ALT、AST和總膽紅素TBil的含量;HE染色測定肝臟的損傷程度。(2)將24只小鼠隨機分為兩組,每組各12只:(1)實驗組小鼠預先用Birinapant(30mg/kg)腹腔注射;(2)對照組小鼠用等量生理鹽水腹腔注射。兩組小鼠在喂養(yǎng)24 h后,用腹腔注射致死劑量LPS(45 mg/kg)的方式構建小鼠膿毒血癥模型,記錄各組小鼠生存時間,Kaplan-Meier法分析小鼠的生存情況。結果:(1)Vehicle組小鼠在腹腔注射LPS后,KCs中c IAP1的表達顯著升高,TRAF3的表達顯著降低,且呈時間依賴性。而Birinapant組c IAP1和TRAF3的表達無顯著變化,Vehicle組和Birinapant組相比,c IAP1以及TRAF3在兩組相同時間點的蛋白表達水平具有統(tǒng)計學差異(P0.05);(2)免疫共沉淀結果顯示TRAF3和K48泛素化直接作用,與Vehicle組相比,Birinapant組TRAF3的K48泛素化水平明顯降低;(3)TRAF3和c IAP1的免疫組化結果和Western blot的結果基本一致;(4)Birinapant組能夠顯著抑制LPS介導p38和JNK的磷酸化;(5)血生化和ELISA檢測顯示,Birinapant組與Vehicle組相比,血清中TNF-α、IL-1、ALT、AST以及TBil的含量明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);(6)Birinapant能夠抑制LPS誘導的肝臟損傷;(7)Birinapant預處理組小鼠中位生存期為58.0 h,72 h的存活率為75.0%;對照組小鼠在腹腔注射致死劑量的LPS后中位生存期為36.0 h,72 h的存活率僅為16.7%,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:(1)Birinapant通過抑制活化的KCs中c IAP1的表達,抑制TRAF3的K48泛素化,從而抑制TRAF3的降解,通過抑制MAPK信號通路的激活,抑制促炎因子的釋放,有效減輕肝臟炎癥反應和肝臟組織損傷;(2)Birinapant有效延長膿毒血癥小鼠的生存時間。
【圖文】：

1 h，2 h 及 4 h 時間點 SMAC、cIAP1 和 TRAF3 蛋白表達，，*P＜0.05，**re 1-1 the protein expression of SMAC, cIAP1 and TRAF3 in 0 h, 1 h, 2 h and 4 h0.05, ** P＜0.01

1 h，2 h 及 4 h 時間點 SMAC、cIAP1 和 TRAF3 蛋白表達，*P＜0.05，** P＜0.01Figure 1-1 the protein expression of SMAC, cIAP1 and TRAF3 in 0 h, 1 h, 2 h and 4 h. *P＜0.05, ** P＜0.01
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

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本文編號：2641327