【摘要】：粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是血液系統(tǒng)最常見的生長因子之一,它可以促進骨髓中造血祖細(xì)胞分化成熟為中性粒細(xì)胞集落和巨噬細(xì)胞集落。目前,細(xì)胞因子GM-CSF在臨床上廣泛用于治療骨髓發(fā)育不全綜合征、再生障礙性貧血、腫瘤放療和化療引起的粒細(xì)胞減少等,其最嚴(yán)重的不良反應(yīng)即為骨痛,發(fā)生率高達90%。有研究表明,細(xì)胞因子GM-CSF在外周神經(jīng)重塑以及骨轉(zhuǎn)移癌疼痛等方面發(fā)揮重要作用;GM-CSF受體抗體及GM-CSF受體敲低均可以顯著緩解骨轉(zhuǎn)移癌疼痛。GM-CSF受體大量表達于小鼠背根神經(jīng)節(jié),激活后主要通過三種信號途徑進行信號傳導(dǎo),包括Jak-Stat信號通路、MEK/ERK絲裂原活化蛋白激酶信號通路和PI3K激酶信號通路,這些信號通路都直接或間接參與疼痛的調(diào)節(jié)。然而目前對于GM-CSF調(diào)節(jié)背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元離子通道功能從而介導(dǎo)痛覺行為,以及所涉及的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并不清楚。DRG神經(jīng)元是痛感覺傳入的初級神經(jīng)元,是痛感覺信號產(chǎn)生傳導(dǎo)的重要部位。在疼痛信號刺激下,背根神經(jīng)節(jié)上的傷害感受器能夠?qū)⒏鞣N傷害性熱、機械、化學(xué)信號轉(zhuǎn)化成電信號傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。成年大鼠背根神經(jīng)節(jié)上至少表達五種不同的電壓門控性鈉通道,包括對TTX敏感的Nav1.1、Nav1.6和Nav1.7鈉通道,以及對TTX不敏感的Nav1.8和Nav1.9鈉通道。Nav1.7,Nav1.8和Nav1.9鈉通道均主要分布在小直徑的DRG神經(jīng)元,與疼痛的發(fā)生關(guān)系最為密切。Nav1.7通道突變會導(dǎo)致遺傳性紅斑肢痛病(inherited erythromelalgia,IEM)、陣發(fā)性極度疼痛障礙(paroxysmal extremepain disorder,PEPD)、先天性痛覺缺失(congenital insensitivity topain,CIP)等疾病,Nav1.8基因的功能獲得性突變可能與疼痛性周圍神經(jīng)病變有關(guān),Nav1.9通道突變也會導(dǎo)致家族性發(fā)作型疼痛綜合癥。我們前期工作篩選了給予GM-CSF刺激后背根神經(jīng)元中多種已報道和疼痛相關(guān)離子通道的mRNA表達水平,結(jié)果顯示Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道m(xù)RNA表達水平顯著增高。在此基礎(chǔ)上,我們對GM-CSF上調(diào)Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道與痛覺的關(guān)系以及機制進行了深入研究。本論文將分為兩部分:第一部分:通過DRG套管直接給藥模型,探討直接在DRG給GM-CFS上調(diào)Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道引起大鼠痛覺行為的作用;第二部分:探究GM-CSF誘導(dǎo)Nav1.7,Nav1.8,Nav1.9上調(diào)的機制。第一部分背跟神經(jīng)節(jié)局部給予GM-CSF上調(diào)Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道并引起大鼠痛覺行為目的:探究GM-CSF靶向DRG給藥后,對DRG神經(jīng)元中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9 mRNA表達水平及大鼠疼痛行為的影響。方法:(1)建立靶向DRG套管給藥模型,將套管插入并固定在大鼠DRG(L5)位置,通過套管局部給予GM-CSF,使用von Frey纖維針測量大鼠的機械刺痛閾值,使用熱輻射裝置測量大鼠的熱痛閾值,觀察大鼠的疼痛行為;(2)體外分離培養(yǎng)DRG神經(jīng)元,GM-CSF孵育4小時或24小時后,采用實時熒光定量PCR檢測DRG神經(jīng)元中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9鈉通道m(xù)RNA表達水平;(3)通過套管局部注射Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9鈉通道的反義核苷酸敲低大鼠DRG(L5)中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9的表達水平,探究Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9鈉通道在GM-CSF引起痛覺行為中的作用。結(jié)果:(1)GM-CSF通過DRG套管給藥可以濃度依賴性地引起大鼠機械刺痛和輻射熱痛痛閾閾值降低。通過套管給大鼠注射200 ng或20 ng GM-CSF后于第1 h、2 h、5 h、12 h、24 h分別測定大鼠的機械刺痛和輻射熱痛痛閾,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比大鼠的機械刺痛痛閾和輻射熱痛痛閾顯著降低(*P0.05),但是注射2 ng GM-CSF后對大鼠的疼痛行為沒有影響。(2)用GM-CSF孵育培養(yǎng)DRG細(xì)胞4 h后,與control相比,Nav1.7(1.45±0.18倍,n=11,*P0.05)、Nav1.8(3.8±0.4倍,n=11,*P0.05)、Nav1.9(1.56±0.15倍,n=11,*P0.05)mRNA的表達水平顯著升高;孵育24h后,Nav1.7(1.75±0.23倍,*P0.05)、Nav1.8(2.25±0.3倍,*P0.05)、Nav1.9 mRNA(1.6±0.23倍,*P0.05)的表達水平也顯著升高。(3)靶向DRG注射Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9反義核苷酸,分別敲低大鼠DRG(L5)Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道的表達水平后給予GM-CSF于第1 h、2 h、5 h、12 h、24 h分別測定大鼠的機械刺痛和輻射熱痛痛閾,發(fā)現(xiàn)敲低Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道的表達水平后逆轉(zhuǎn)了GM-CSF引起的疼痛行為。結(jié)論:GM-CSF可能是通過增高DRG中的Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9鈉通道表達水平從而引起疼痛。第二部分GM-CSF通過Jak2-Stat3信號通路上調(diào)Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道m(xù)RNA表達水平目的:探究細(xì)胞因子GM-CSF誘導(dǎo)Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道m(xù)RNA表達水平上調(diào)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)機制。方法:(1)體外分離培養(yǎng)DRG神經(jīng)元,孵育GM-CSF及信號通路阻斷劑,實驗分為四組,分別為control組,GM-CSF組,AG490+GM-CSF組(AG490為Jak2阻斷劑),Stattic+GM-CSF組(Stattic為Stat3阻斷劑),在加入GM-CSF之前分別將阻斷劑AG490提前15 min,Stattic提前30 min加入到細(xì)胞中,采用實時熒光定量PCR檢測給予Jak2和Stat3特異性抑制劑后,DRG神經(jīng)元中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9鈉通道m(xù)RNA表達水平。(2)體外分離培養(yǎng)DRG神經(jīng)元,孵育GM-CSF,采用免疫熒光技術(shù)檢測給予Jak2特異性抑制劑前后,DRG神經(jīng)元中Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9鈉通道蛋白表達水平。(3)通過套管局部注射Jak2、Stat3和Stat5a反義核苷酸敲低大鼠DRG(L5)中Jak2、Stat3和Stat5a的表達水平,經(jīng)套管再給予GM-CSF觀察大鼠的疼痛行為。結(jié)果:(1)mRNA表達水平。采用實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,DRG神經(jīng)元孵育GM-CSF后,三個Na~+通道m(xù)RNA的表達水平與對照組相比顯著增加:Nav1.7(1.45±0.18倍,n=11,*P0.05)、Nav1.8(3.8±0.4倍,n=11,*P0.05)、Nav1.9(1.56±0.15倍,n=11,*P0.05);Jak2的特異性拮抗劑AG490預(yù)處理背根神經(jīng)元后再加入GM-CSF刺激即AG490+GM-CSF組,結(jié)果顯示三個Na~+通道m(xù)RNA的表達水平與GM-CSF組相比顯著降低:Nav1.7(0.63±0.13倍,n=6,~#P0.05)、Nav1.8(0.52±0.19倍,n=6,~#P0.05)、Nav1.9(0.72±0.15倍,n=6,~#P0.05);Stat3的特異性拮抗劑Stattic預(yù)處理背根神經(jīng)元后再加入GM-CSF刺激即Stattic+GM-CSF組,結(jié)果顯示三個Na~+通道的表達水平與GM-CSF組相比顯著降低:Nav1.7(0.4±0.22倍,n=6,~#P0.05)、Nav1.8(0.68±0.17倍,n=10,~#P0.05)、Nav1.9(0.26±0.12倍,n=6,~#P0.05)。(2)蛋白表達水平。孵育GM-CSF后,與control組相比Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9鈉通道蛋白的表達水平顯著升高;Jak2的特異性拮抗劑AG490預(yù)處理背根神經(jīng)元后再加入GM-CSF刺激即AG490+GM-CSF組,與GM-CSF組相比結(jié)果顯示Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道蛋白的表達水平顯著降低(*P0.05 GM-CSF組與control組比較;~#P0.05AG490+GM-CSF組與GM-CSF組比較)。(3)通過套管局部注射Jak2、Stat3、Stat5a反義核苷酸分別敲低大鼠DRG(L5)Jak2、Stat3、Stat5a表達水平后,給予細(xì)胞因子GM-CSF于第1 h,2 h,5 h,12 h,24 h,48 h分別測定大鼠的機械刺痛和輻射熱痛痛閾,發(fā)現(xiàn)敲低Jak2、Stat3表達水平后逆轉(zhuǎn)了GM-CSF引起的疼痛行為(~#P0.05與單獨給予GM-CSF組比較),而反義核苷酸敲低Stat5a后,再給予細(xì)胞因子GM-CSF,大鼠仍然出現(xiàn)明顯的機械疼痛和熱疼痛反應(yīng)。結(jié)論:Jak2-Stat3信號通路是GM-CSF上調(diào)Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9通道表達引起痛覺行為的關(guān)鍵靶信號通路。
【圖文】：

圖 1 套管手術(shù)操作流程圖Fig. 1 The DRG cannula implant(A) A set of pictures of the DRG cannula surgery. (B) Schematic of the DRcannula implant[31,32].

圖 2 GM-CSF 對大鼠疼痛行為的影響Fig. 2 The effect of GM-CSF on nociceptive behavior of ratsDose-dependent effects of GM-CSF onpaw withdrawal threshold mechanical stimulus (A) or paw withdrawal latency to noxious heat (B) at 12 h, 5 h, 12 h and 24 h following focal DRG application via DRG cannuNumber of experiments is indicated as n in each panel. *P < 0.05 as comparto the vehicle saline.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R338.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 焦悅;郭建友;李守業(yè);朱妍;李昌煜;;神經(jīng)病理性疼痛的受體機制研究進展[J];中國藥理學(xué)通報;2012年05期

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本文編號：2641480