【摘要】：目的:構(gòu)建兔椎間盤(pán)退變的動(dòng)物模型,利用慢病毒(lentivirus vector,LV)介導(dǎo)MMP3-siRNA和Sox9雙基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染兔退變髓核細(xì)胞,探討單基因及雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染兔退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。方法:1.4月齡新西蘭大白兔使用針刺纖維環(huán)法構(gòu)建兔椎間盤(pán)退變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,手術(shù)后4周、8周行核磁共振檢查及病理學(xué)檢測(cè),觀察目的椎間盤(pán)的退變情況,及目的椎間盤(pán)造模成功情況。2.30只建模成功的新西蘭大白兔隨機(jī)分為6組,分別為(1)空白對(duì)照組,(2)PBS對(duì)照組,(3)空病毒組,(4)MMP3組,(5)Sox9組,(6)雙基因組(MMP3-siRNA+Sox9),分別于造模的椎間盤(pán)髓核用微量注射器注入20μL:PBS磷酸鹽緩沖液、r LVX-mCMV-mcherry、rLVX-CMV-hMMP3-sh RNA-m CMVmcherry、rLVX-CMV-h Sox9-mCMV-mcherry、rLVX-CMV-hMMP3-sh RNA-m CMVmcherry+rLVX-CMV-hSox9-m CMV-mcherry。于注射后8、12、24周行MRI檢查觀察椎間盤(pán)退變情況。術(shù)后24周空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,取出目的椎間盤(pán)組織,行Western-Blot檢查II型膠原、蛋白多糖水平的表達(dá),行RT-PCR檢查MMP3mRNA和Sox9 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:1.手術(shù)成功后4周、8周對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行腰椎MRI檢查,獲得其核磁共振的T2WI像。第8周手術(shù)組椎間盤(pán)的MRI的T2WI像信號(hào)開(kāi)始減弱,病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果示椎間盤(pán)呈退變改變,提示造模成功。2.將目的基因轉(zhuǎn)染到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后8、12、24周行磁共振檢查:空白對(duì)照組、PBS組、空病毒組退變椎間盤(pán)MRI的T2WI像信號(hào)強(qiáng)度明顯低于MMP3、Sox9和雙基因組�？瞻讓�(duì)照組、PBS組、空病毒組兩兩比較MRI的T2WI像信號(hào)強(qiáng)度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);MMP3組、Sox9組MRI的T2WI像信號(hào)強(qiáng)度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);MMP3組、Sox9組與雙基因組MRI的T2WI像分別比較顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。術(shù)后第24周,Western-Blot檢查各組II型膠原、蛋白多糖表達(dá),其中MMP3組、Sox9組和雙基因組的II型膠原表達(dá)量有不同程度提高,雙基因組II型膠原的表達(dá)均高于其他各組(P0.05)。MMP3組和雙基因組蛋白多糖的表達(dá)高于其他組(P0.05),Sox9組與PBS組、空病毒組比較,蛋白多糖表達(dá)未見(jiàn)明顯升高(P0.05),雙基因組II型膠原的表達(dá)均高于其他各組(P0.05);RT-PCR檢查各組MMP3、Sox9 mRNA的表達(dá)情況,其中MMP3組、雙基因組與PBS組、空病毒組、Sox9組比較MMP3mRNA表達(dá)水平明顯降低(P0.05),其中雙基因組MMP3 mRNA的表達(dá)水平均低于其他各組(P0.05)。Sox9組和雙基因組與PBS組、空病毒組及MMP3組比較Sox9 mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P0.05),其中雙基因組Sox9 m RNA的表達(dá)水平均高于其他各組(P0.05)。結(jié)論:1.針刺纖維環(huán)法構(gòu)建兔退變椎間盤(pán)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型方法成功有效,術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物椎間盤(pán)影像學(xué)及病理學(xué)檢查均顯示造模成功。2.慢病毒介導(dǎo)MMP3-siRNA和Sox9雙基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)兔退變髓核細(xì)胞有明顯的延緩椎間盤(pán)退變的作用,明顯的促進(jìn)了退變椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)中II型膠原,MMP3-si RNA基因的轉(zhuǎn)染促進(jìn)蛋白多糖的表達(dá),Sox9基因過(guò)表達(dá)不會(huì)促進(jìn)蛋白多糖的表達(dá)。
【圖文】：

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文2． 實(shí)驗(yàn)方法2.1 術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉術(shù)前常規(guī)禁食 24 小時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)耳緣靜脈使用 1.5%戊巴比妥鈉 2ml/kg 進(jìn)行注射麻醉。麻醉成功后動(dòng)物取右側(cè)臥位固定于兔實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。2.2 定位及手術(shù)手術(shù)經(jīng)右側(cè)腹膜外入路，選取兔腰背部右側(cè)肋弓下緣至右側(cè)髂棘處剃毛備皮，備皮分為約 18*10cm 區(qū)域。依次定位 L1-L7腰椎棘突，選取 L3-L7橫突下緣作為手術(shù)切口。（圖 1、2）

圖 3、4 針刺椎間盤(pán)及術(shù)后切口縫合2.3 術(shù)后處理術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物當(dāng)天禁食，術(shù)后第一天常規(guī)進(jìn)食、進(jìn)水，術(shù)后 3 天每天給予青霉素 G 鈉 80 萬(wàn) UI 肌肉注射預(yù)防感染。3． 觀察方法及指標(biāo)3.1 術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況術(shù)后密切觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉蘇醒后的活動(dòng)情況、術(shù)后 3 天觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的切口是否感染、愈合及存活情況。3.2 病理學(xué)檢測(cè)術(shù)后 8 周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察目的椎間盤(pán)鏡下 HE 染色及免疫組織化學(xué)表現(xiàn)。3.3 MRI 掃描檢查實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后 4 周、8 周進(jìn)行核磁共振檢查，觀察椎間盤(pán)退變情況。實(shí)驗(yàn)動(dòng)
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R681.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2641296