【摘要】：背景：胃動(dòng)素(Motilin, MTL)由22個(gè)氨基酸組成,最早被J.C. Brown在豬十二指腸粘膜分離出來,是由小腸上段和空腸黏膜的Mo內(nèi)分泌細(xì)胞合成的一種腦腸肽。胃動(dòng)素主要通過與胃動(dòng)素受體相結(jié)合發(fā)揮作用。米勒等認(rèn)為,胃動(dòng)素受體在神經(jīng)及平滑肌表達(dá)不同的結(jié)合特性和藥理功能,故胃動(dòng)素受體可分為神經(jīng)型(N)和肌肉型(M)兩種亞型。但在血管上是否存在胃動(dòng)素受體少有報(bào)道。我們課題組在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在消化間期,狗在意識(shí)清醒的狀態(tài)下,靜止期(Ⅰ相)時(shí),胃血流是穩(wěn)定的,而在收縮期(Ⅱ和Ⅲ相),胃左動(dòng)脈的血流水平提高到靜止期水平的240%,持續(xù)可達(dá)30分鐘。進(jìn)入靜止期30分鐘以后,若在狗的靜脈內(nèi)持續(xù)性滴注胃動(dòng)素,可在誘導(dǎo)出現(xiàn)與MMCIII期類似的胃及十二指腸運(yùn)動(dòng)的同時(shí),也誘導(dǎo)了胃左動(dòng)脈血流的增加,其類似于自然發(fā)生的周期性胃左動(dòng)脈血流的變化。當(dāng)停止輸注胃動(dòng)素時(shí),胃左動(dòng)脈血流的高度迅速恢復(fù)到靜止期水平。而胃動(dòng)素受體拮抗劑(GM-109)則能完全抑制胃動(dòng)素誘導(dǎo)的和自然發(fā)生的周期性胃血流的增加和胃和十二指腸運(yùn)動(dòng),且GM-109持續(xù)性輸注停止以后,立即出現(xiàn)胃左動(dòng)脈血流的升高和胃及十二指腸的運(yùn)動(dòng)。而在腸系膜上動(dòng)脈及腸系膜下動(dòng)脈均未發(fā)現(xiàn)上述類似變化。在此次實(shí)驗(yàn)中,我們通過對(duì)狗胃腸道動(dòng)脈上胃動(dòng)素受體表達(dá)的研究,從組織細(xì)胞層面澄清了胃動(dòng)素誘發(fā)消化間期在體狗胃左動(dòng)脈周期性舒張的靶受體在胃左動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞膜上,這為進(jìn)一步研究胃動(dòng)素對(duì)消化間期胃動(dòng)脈血流量的調(diào)節(jié)的分子機(jī)制提供了有利的支持。胃動(dòng)素通過與胃動(dòng)素受體結(jié)合,在消化間期周期性地釋放并調(diào)節(jié)胃腸道的移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)(MMC)。MMC是人和哺乳動(dòng)物與生俱來的基本運(yùn)動(dòng)形式,在整體生命活動(dòng)中具有非常重要的生理意義,因此研究胃動(dòng)素受體在整個(gè)胃腸道的分布、結(jié)構(gòu)和功能對(duì)治療胃腸動(dòng)力性疾病具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。目的：1.研究胃動(dòng)素受體在離體狗胃動(dòng)脈上的表達(dá),并與腸動(dòng)脈的表達(dá)強(qiáng)度相比較；2.研究胃動(dòng)素受體在離體狗的胃腸道管壁的分布并對(duì)表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行比較。方法：1.用免疫組織化學(xué)方法(S-P法)及免疫熒光雙重染色方法檢測(cè)胃動(dòng)素受體在狗胃左動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈、腸系膜下動(dòng)脈上的表達(dá)；2.用RT-PCR法檢測(cè)胃動(dòng)素受體mRNA在狗胃左動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈、腸系膜下動(dòng)脈上的表達(dá)；3.用Western blot法檢測(cè)胃動(dòng)素受體蛋白在狗胃左動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈、腸系膜下動(dòng)脈上的表達(dá)。4.聯(lián)合應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(S-P法)及RT-PCR法檢測(cè)胃動(dòng)素受體在狗整個(gè)胃腸道各部位的表達(dá)并對(duì)表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行比較；結(jié)果：1.免疫組織化學(xué)方法(S-P法)染色發(fā)現(xiàn)胃動(dòng)素受體位于動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上,且相對(duì)于腸系膜上動(dòng)脈及腸系膜下動(dòng)脈,主要在胃左動(dòng)脈上呈免疫組化強(qiáng)陽性表達(dá),即動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒(P0.01)；2.免疫熒光雙重染色方法進(jìn)一步確認(rèn)胃動(dòng)素受體位于動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞膜上,且胃左動(dòng)脈的免疫熒光強(qiáng)度明顯高于腸系膜上動(dòng)脈及腸系膜下動(dòng)脈(P0.01)；3.RT-PCR法檢測(cè)到狗胃左動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈、腸系膜下動(dòng)脈上胃動(dòng)素受體mRNA的表達(dá),胃動(dòng)素受體mRNA的表達(dá)量依次為胃左動(dòng)脈腸系膜上動(dòng)脈腸系膜下動(dòng)脈,與免疫組化及免疫熒光結(jié)果相一致(P0.01)；4.Western blot法檢測(cè)到胃動(dòng)素受體蛋白在狗胃左動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈、腸系膜下動(dòng)脈上的表達(dá),在狗胃左動(dòng)脈表達(dá)量最高,其次為腸系膜上動(dòng)脈,在腸系膜下動(dòng)脈上最低,這與RT-PCR結(jié)果相吻合(P0.01)；5.免疫組織化學(xué)方法(S-P法)染色發(fā)現(xiàn)胃動(dòng)素受體在狗胃竇、十二指腸、回腸、空腸、近端結(jié)腸、中端結(jié)腸的肌間神經(jīng)纖維和腸肌間神經(jīng)叢均呈免疫組化陽性表達(dá),而遠(yuǎn)端結(jié)腸呈陰性表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為：十二指腸回腸空腸近端結(jié)腸胃竇中端結(jié)腸遠(yuǎn)端結(jié)腸(P0.05)；6.RT-PCR法檢測(cè)到狗胃竇、十二指腸、回腸、空腸、近端結(jié)腸、中端結(jié)腸胃動(dòng)素受體mRNA的表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為：十二指腸回腸空腸近端結(jié)腸胃竇中端結(jié)腸遠(yuǎn)端結(jié)腸(P0.05)。結(jié)論：1.胃動(dòng)素受體位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上；2.在支配胃腸道的動(dòng)脈系中,胃動(dòng)素受體在胃左動(dòng)脈上呈優(yōu)勢(shì)表達(dá),腸系膜上動(dòng)脈上呈弱陽性表達(dá),腸系膜下動(dòng)脈呈陰性表達(dá)；3.胃動(dòng)素受體分布于除了遠(yuǎn)端結(jié)腸以外整個(gè)狗的胃腸道肌間神經(jīng)叢和神經(jīng)纖維；4.胃動(dòng)素受體在狗胃腸道的表達(dá)強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為：十二指腸回腸空腸近端結(jié)腸胃竇中端結(jié)腸遠(yuǎn)端結(jié)腸。
【圖文】：

Trizol法提取總RNA具體過程

ｃ逡逑圖２．３邋ＬＧＡ上ＭＴＬＲ染色（一抗１：１００稀釋）逡逑圖２．３為ＬＧＡ上ＭＴＬＲ的免疫組化染色（４０0ｘ），陽性染色為沿逡逑動(dòng)脈內(nèi)皮出現(xiàn)蹤黃色顆粒（黑色箭頭）；Ａ；染核的ＬＧＡＭＴＬＲ的逡逑表法；Ｂ；未染核的ＬＧＡ邋ＭＴＬＲ的表達(dá)；Ｃ；陰性對(duì)照。逡逑４５逡逑
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R333

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本文編號(hào)：2640619