【摘要】：作為重要的食源性病原菌之一,空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)主要引起人的胃腸炎,甚至引發(fā)神經(jīng)性疾病如格林巴利綜合癥等。大環(huán)內(nèi)酯類藥物如紅霉素是治療空腸彎曲菌感染的首選藥物,但由于長期不適當使用,空腸彎曲菌對該類藥物產(chǎn)生了耐藥性,使抗生素治療效率下降,嚴重威脅人類臨床醫(yī)療健康。造成空腸彎曲菌對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的主要原因有堿基替換、核糖體蛋白突變和外排泵作用,此外,erm基因編碼的甲基化酶也是造成大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的主要原因之一。本研究分別采用轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學和代謝組學技術探索空腸彎曲菌ermB基因攜帶菌株和對照菌株的差異譜及相應的生物學功能,從RNA水平、蛋白水平和代謝物水平研究空腸彎曲菌中ermB基因表達的適應性代償分子調(diào)控機制。轉(zhuǎn)錄組學分析,通過提取空腸彎曲菌ermB基因攜帶菌株和對照菌株的全菌RNA,構建cDNA文庫,RNA-Seq高通量測序技術對文庫進行測序,參考C.jejuni NCTC 11168標準菌株基因組,經(jīng)數(shù)據(jù)預處理過濾掉不合格的讀取,基因表達量FPKM標準化后進行轉(zhuǎn)錄本相對定量,共篩選到58個差異轉(zhuǎn)錄本,其中1個發(fā)生上調(diào),上調(diào)倍數(shù)為5.52倍;57個發(fā)生下調(diào),下調(diào)倍數(shù)為3.33-426.95倍。對這些差異轉(zhuǎn)錄本進行生物功能分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因cj1477c參與乙醛酸鹽和二元羧酸鹽代謝;下調(diào)基因flgE、flgK、flaA、flaB、fliD、flgS、flgD、flg1、flgE2、flgH、cj0887c、flgB、flgG、flgG2、fliS、flgC參與細菌鞭毛的組裝,hisH、hisF參與組氨酸代謝,cj0489參與乙醛酸鹽和二元羧酸鹽代謝,pseB、pseC、ptmB參與氨基糖和核苷糖代謝。qRT-PCR對部分差異轉(zhuǎn)錄本進行表達量驗證,結(jié)果與測序數(shù)據(jù)計算的變化倍數(shù)一致,表明了測序的準確性和可靠性。蛋白組學分析,采用超聲破碎法提取空腸彎曲菌ermB基因攜帶菌株和對照菌株的全菌蛋白質(zhì),FASP法酶解蛋白為肽段,采用MRM-MS技術對差異轉(zhuǎn)錄本對應的產(chǎn)物蛋白進行相對定量。共篩選到20個差異蛋白質(zhì),其中4個發(fā)生上調(diào),上調(diào)倍數(shù)為1.52-4.71倍;16個發(fā)生下調(diào),下調(diào)倍數(shù)為1.66-79.64倍。對這些差異蛋白質(zhì)進行GO注釋和KEGG分析,發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白Cj1450參與ATP/GTP綁定過程,FlgG2參與鞭毛基體桿組裝及依賴于鞭毛的細胞運動,Cj0850c參與轉(zhuǎn)運過程,Cj1422c參與糖轉(zhuǎn)移過程;下調(diào)蛋白FlgD、FlgE2、FlgI、FlaB、FlaA、FlgG參與細菌結(jié)構分子活動,FlgE2、FlaB、FlaA、FlgD參與依賴于鞭毛的細胞運動,FlgE2、FlaB、FlaA、FlgD、FlgI、FlgG、PtmA 參與鞭毛組裝,Cj1477c、Cj1476c、HisF、PtmA、HisH 參與代謝通路,Cj1477c、HisF2、HisH1參與生物二級代謝物合成,PseB、PseC參與氨基糖和核苷糖代謝,HisF2、HisH1參與組氨酸代謝和氨基酸的生物合成,FlaB、FlaA、FlgS為雙組分系統(tǒng)相關蛋白。通過負染及電鏡觀察細菌鞭毛表明ermB基因攜帶菌株鞭毛絲缺失,而敏感株鞭毛完整。運動性、自身凝集性及細胞實驗結(jié)果顯示ermB基因攜帶菌株運動性減弱,自身凝集性降低,對HEp-2、VERO和IEC-6細胞粘附力和侵襲力均減弱。ELISA檢測結(jié)果表明ermB基因的表達使空腸彎曲菌的葡萄糖和ATP含量上調(diào),次黃嘌呤含量下調(diào)。代謝組學分析,采用液氮淬滅細菌代謝,冷甲醇凍融循環(huán)提取全菌代謝物,C18柱和HILIC柱分離代謝物,QTOF-MS檢測特征離子,MarkerLynx軟件多元統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),共篩選鑒定到36個差異代謝物,其中14個發(fā)生上調(diào),上調(diào)倍數(shù)為1.50-10.65倍;22個發(fā)生下調(diào),下調(diào)倍數(shù)為1.51-12.70倍。對這些差異代謝物進行HMDB和KEGG分析,其主要參與細菌細胞信號功能(3個上調(diào),5個下調(diào)),膜的完整性和穩(wěn)定性(3個上調(diào),5個下調(diào)),能量的來源和儲存(3個上調(diào),5個下調(diào))及營養(yǎng)(4個上調(diào),3個下調(diào))等生物功能。根據(jù)差異代謝譜生物功能和細胞定位的結(jié)果,檢測細菌生物膜形成能力,結(jié)果表明ermB耐藥菌的生物膜形成能力減弱。綜上所述,ermB基因在空腸彎曲菌中表達產(chǎn)生耐藥表型后,導致空腸彎曲菌鞭毛絲缺失,運動能力減弱,自身凝集性降低,粘附力和侵襲力降低,葡萄糖和ATP含量上升。同時,次黃嘌呤含量顯著下調(diào)。上述研究結(jié)果進一步闡明了空腸彎曲菌中ermB基因耐藥調(diào)控的分子機制,為空腸彎曲菌耐藥性的防控提供了科學依據(jù)。
【圖文】：

邐１邋１邋ｉＭ逡逑Ｇｅｎｅ邋１２邋３邋４逡逑圖１－１邋ＤＮＡ微陣列技術原理圖（引自Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＤＮＡ邋ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ逡逑ＲＮＡ－Ｓｅｑ技術Ｍ將高通域測序方法與計算方法結(jié)合起來，以捕獲和Ｍ化ＲＮＡ提取物中的轉(zhuǎn)逡逑錄本｜１Ｗ１。生成的核苷酸序列的長度一般在ｌＯＯｂｐ左右，但根據(jù)使用的測序方法，可以從３０個ｂｐ逡逑到１０，０００個ｂｐ不等。與ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ相比，ＲＮＡ－Ｓｅｑ中５個數(shù)保級的動態(tài)范圍是一人優(yōu)勢。此外，逡逑需要的進樣量也較少，ＲＮＡ－Ｓｅｑ為納克級，ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ為微克級。理論上，ＲＮＡ－Ｓｅｑ技術沒有逡逑定量上限，在測量非重復區(qū)域ｌＯＯｂｐ片段時背景值很低�？梢酝ㄟ^富集０標ＲＮＡ或刪除己知豐逡逑度的ＲＮＡ來提高ＲＮＡ－Ｓｅｑ的靈敏度。ｍＲＮＡ分子可以用綁定到ｐｏｌｙ－Ａ尾的霖核ｔ）：酸探針分開。逡逑轉(zhuǎn)錄分子被制備好后，可進行單向或雙向測序，特定ｓｔｒａｎｄ的ＲＮＡ－Ｓｅｑ方法可保留測序轉(zhuǎn)錄本逡逑的ｓｔｒａｎｄ的信息［ｍ］。ＲＮＡ－Ｓｅｑ原理見圖卜２。在生物體中，，基閃被轉(zhuǎn)錄并拼接（在寅．核生物中）以逡逑產(chǎn)生成熟的信使ＲＮＡ轉(zhuǎn)錄本（圖中紅色標記）。ｍＲＮＡ從生物體中提取

圖２－２邋２３Ｓ邋ｒＲＮＡ２０７４及２０７５位測序圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ｏｆ邋ｐｏｉｎｔ邋２０７４邋ａｎｄ邋２０７５邋ｏｆ邋２３Ｓ邋ｒＲＮＡ逡逑注：ａ為ＣＴ－１１１６８的２３Ｓ邋ｒＲＮＡ２０７４和２０７５位測序圖譜，ｂ為ＣＪ－ｅｒｍＢ的２３Ｓ邋ｒＲＮＡ２０７４和．２０７５位測序圍譜逡逑２．３．２邋ＭＩＣ邋測定逡逑對ＣＪ－１１１６８及ＣＪ－ｅｒｍＢ的ＭＩＣ測定結(jié)果表明ＣＪ－１丨１６８對紅霉素及克林霉襲均敏感，ＣＪ－ｅｒ?qū)t霉素及克林霉素耐藥，且ＭＩＣ分別提高了邋１２８倍及１０２４倍（表２－４）。且２＿３．１結(jié)果己
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：2636177