【摘要】：中藥藥效物質(zhì)研究是中藥現(xiàn)代化進(jìn)程重要內(nèi)容。由于中藥成分復(fù)雜,從中藥混合物中篩選發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)具有一定難度。本文建立了分子水平篩選與活體篩選相結(jié)合的中藥活性成分篩選方法,著重研究了基于小分子化學(xué)探針和斑馬魚模型的3種中藥活性物質(zhì)篩選方法。本論文研究?jī)?nèi)容主要包括:1.建立了一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)效應(yīng)探針的SIRT3調(diào)節(jié)劑篩選方法。設(shè)計(jì)了基于AIE效應(yīng)的小分子探針,由一個(gè)作為熒光發(fā)色基團(tuán)的四苯基乙烯(TPE),與SIRT3酶能夠識(shí)別的底物多肽Gln-Lys(Ac)-Arg-Phe-Asn通過(guò)固相合成得到。通過(guò)對(duì)體外反應(yīng)體系的pH、緩沖鹽濃度、探針濃度等因素的優(yōu)化,該探針能夠在體外特異性檢測(cè)SIRT3活性,并具有較低的檢測(cè)限。有望用于中藥中SIRT3調(diào)節(jié)劑篩選。2.建立了 一種基于花生四烯酸誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型的中藥活性物質(zhì)篩選方法,并用于丹紅注射液活性成分篩選與質(zhì)量評(píng)價(jià)。采用鄰聯(lián)茴香胺對(duì)斑馬魚心臟與尾部紅細(xì)胞染色并獲取血栓的顯微圖像,以心臟紅細(xì)胞強(qiáng)度為指標(biāo)評(píng)價(jià)血栓形成情況。結(jié)果表明,該模型能夠較準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)陽(yáng)性藥阿司匹林的抗血栓活性。運(yùn)用該方法評(píng)價(jià)了丹紅注射液的抗血栓活性,發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能劑量依賴性地減輕花生四烯酸誘導(dǎo)的斑馬魚血栓,丹參與紅花提取物也有較好抗血栓活性。篩選出丹紅注射液中迷迭香酸、對(duì)香豆酸等抗血栓活性成分,進(jìn)一步結(jié)合對(duì)丹紅注射液中化合物含量分析,發(fā)現(xiàn)迷迭香酸和對(duì)香豆酸可作為丹紅注射液抗血栓活性相關(guān)質(zhì)量標(biāo)志物。并且該方法有望用于批次一致性評(píng)價(jià)。3.建立了一種基于化學(xué)探針與斑馬魚血瘀血虛模型相結(jié)合的中藥活性多重評(píng)價(jià)方法。對(duì)綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記血紅蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚用苯肼?lián)p傷,通過(guò)熒光成像獲取血液流動(dòng)情況來(lái)定性表征血瘀血虛證型。采用小分子探針NP3特異性地原位檢測(cè)斑馬魚體內(nèi)過(guò)氧化亞硝酸鹽ONOO-,以探針熒光強(qiáng)度來(lái)描述斑馬魚氧化應(yīng)激損傷和炎癥程度,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP標(biāo)記的紅細(xì)胞強(qiáng)度并以此為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)血瘀血虛情況,實(shí)現(xiàn)了雙重活性指標(biāo)檢測(cè)。運(yùn)用該方法評(píng)價(jià)了丹紅注射液及丹參、紅花提取物的活性,表明丹紅注射液能顯著抗紅細(xì)胞損傷和氧化損傷。該方法有望用于雙重指標(biāo)的中藥活性成分篩選。
【圖文】：

２．４．３．１基于質(zhì)譜的反應(yīng)特異性驗(yàn)證逡逑按２．３．３．１方法反應(yīng)并采用質(zhì)譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該探針能夠被ＳＩＲＴ３識(shí)別并生成去逡逑乙酰化產(chǎn)物。從圖２．３質(zhì)譜上看出去乙酰化后生產(chǎn)的產(chǎn)物峰比原來(lái)前移，說(shuō)明其去逡逑乙酰化后溶解度提高。逡逑１００－．逡逑Ａ邋二邋（、？（、邐？0－，邐，＿逡逑—邐ＴＰＥ－ＱＫ（Ａｃ）ＲＦＤ逡逑８０－邐ｓｏ：逡逑Ｐ邋：邐＾邋Ｍ邐ｌ邋－逡逑１邋６0－邐＾邋ｔ邋ｉ邋Ｔ邋３８９７邋卜逡逑Ｑ）邐＿邐ｐ邋Ｎ丨Ｈ邋’：－？邐２０逡逑｜邐４0－邐＂Ｙ邋＊Ｔ邐？：咖邐９yU咖逡逑冬邐＿邐５００邐？０0逡逑Ｕ－邐＿邐ｍ邋？逡逑0邋－邋ｒｌｌＩ邋）邐２３．７３＿２６邋５０邐３邋８／ｇ＿｜邋３９，＾８邋４４．０９邋４９．８２邐６４邋００逡逑Ｂ邋１００１邋—邐Ｌ—Ｊ＾邐＾￣’逡逑８０二邐ＴＰＥ－ＱＫＲＦＤ邐＾逡逑＿邐３邐0邐ｇ邐0邐ｐ邐－逡逑－－邋■邋？邋－邋，邋－邋ｌ邋－ｓ－邋■邋－邋ｉ．邋￣邐■＇逡逑６０邋二邐ｉ邋＃邋Ｓ邋ｔ。邐｜＊°：逡逑—邐ｉ－ｏ邋６ｈ．邋ｃｍ．．邐｜邋０？■逡逑＿邐心邋—邋Ｈ－邐｜邋４０逡逑＿邐ＣＪ逡逑４０－邐…邐３５．０５邐２０：逡逑—邐－２＾９0８邐Ｋ？ｔ？ｉ逡逑—邐ｃｏｏ邐？００逡逑２０—邋＊＂■＇＊逡逑二邐v|６邐３0９逡逑ｒｉ二」“■邋—Ｌ－８９邐２０．１０邋２３．３８＿２７

邐１５０逡逑時(shí)間（ｍｉｎ）逡逑圖２．４探針與ＳＩＲＴ３反應(yīng)前后熒光隨時(shí)間變化逡逑２．４．４邋ＳＩＲＴ３與探針反應(yīng)的最佳體系研究逡逑采用ＳＰＳＳ對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到如圖２．５的結(jié)果。表明反應(yīng)效率相對(duì)最高逡逑時(shí)所采用的條件為Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ濃度為５０ｍＭ，邋ｐＨ＝８，邋ＮＡＤ＋濃度為３ｍＭ。在該條件逡逑下，由圖２．６的總離子流圖可看出：該條件下加入ＳＩＲＴ３反應(yīng)２ｈ后，探針的峰幾逡逑乎完全消失，說(shuō)明探針幾乎被反應(yīng)完全。逡逑ｔｔ＊的ｔｔＷ邊zL均怕邐ｔｔ＊的ｔｔ算邊私均值逡逑邐——ｉ邋，彳邐……邋－ｒ邋一邋一邐／逡逑＾邐＼邐Ｉ邐／逡逑ｔｆ，，邐ｌ邐＼＿＾邐ｚ逡逑？？逡逑１邐Ｓ邐Ｍ邐—８邐￥４邐ＢＳ￣邐０１邐１邐３逡逑Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ？Ｃ；ｆｔ邐ｐＨ邐ＮＡＤ？濃甩逡逑圖２．５正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀圖逡逑２５逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5;R-332

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本文編號(hào)：2636054