【摘要】：組織穩(wěn)態(tài)需要死細胞的去除和新細胞的產生之間保持良好平衡。因為攝入的食物、病原體和毒素會損傷上皮,胃腸道依賴于不斷的自我更新來維持穩(wěn)態(tài)。成體腸道干細胞(intestinal stem cells,ISCs)可以產生腸道上皮的所有成熟細胞類型,在該過程中任何不平衡都可導致疾病的發(fā)生。在成年哺乳動物小腸中,ISC細胞群靠近腸腺隱窩底部,每個隱窩每天約產生300個細胞。這個過程由每個隱窩的4_(~~)6個ISCs支持,ISCs遷移到隱窩中,經歷轉運擴增分裂,分化為腸絨毛的主要成分--腸吸收細胞。許多經典的信號通路包括Notch、BMP和Wnt,已被證明在增殖過程中起關鍵作用。然而,由于缺乏特定的干細胞標記,直到現在也難以精確鑒定和研究這個細胞群。果蠅與哺乳動物的腸道在發(fā)育、細胞組成和遺傳控制方面具有很大的相似性,在腸道病理生理學和再生以及控制它們的信號傳導途徑之間具有相當的保守性。成年果蠅腸道干細胞的發(fā)現為研究腸道干細胞生物學提供了一個新的模型系統(tǒng)。果蠅ISC細胞核小,可特異性表達Notch的配體Delta。ISC進行自我更新產生一個新的ISC和一個未分化成熟的中間過渡細胞(enteroblasts,EBs),ISCs和EB細胞都可以表達Snail/Slug家族的轉錄因子escargot(esg)。EB細胞可分化為具有吸收營養(yǎng)物質功能的腸上皮細胞(enterocytes,ECs)和腸內分泌細胞(enteroendocrine cells,EEs),ECs有大的細胞核,被Pdm1(Nubbin)標記,EE細胞可被Prospero標記。研究果蠅腸道干細胞的自我更新和分化調控機制可以為人類或其它脊椎動物的腸道干細胞的增殖與分化研究提供更多線索。根據現階段的研究進展,我們知道穩(wěn)態(tài)及再生條件下Wnt、Notch、EGFR、JAK-STAT信號通路對腸道干細胞的增殖及分化起著重要的調控作用。通過RNAi果蠅系高通量篩選,研究人員已篩選到405個蛋白編碼基因參與調控果蠅腸道干細胞的增殖與分化。近年來長非編碼RNA受到普遍關注,目前已經發(fā)現了上千個lncRNAs,其在表觀遺傳、轉錄及轉錄后方面發(fā)揮著關鍵的調控作用。非編碼RNA是否參與腸道干細胞增殖與分化的調控過程尚不清楚。利用來自清華大學高冠軍教授實驗室構建的82株lnc RNAs敲除果蠅株,與esg-Gal4果蠅通過遺傳雜交整合在同一株果蠅中。esg可驅動GFP或DsRed在ISC/EB細胞中表達,在lncRNA突變的背景下,觀察GFP或DsRed標記的ISC/EB細胞數目及大小的改變。我們共得到70株整合果蠅株,其中X染色體5株,Ⅱ染色體36株,Ⅲ染色體29株。其中15個lncRNAs在腸道中表達,包括X染色體2個,Ⅱ染色體8個,Ⅲ染色體5個。生理條件下進行篩選,發(fā)現70個lncRNAs均不影響腸道干細胞的增殖;使用Prospero抗體染色篩選了15株整合果蠅株,均不影響腸道干細胞向EE細胞分化。DSS(dextran sulphate sodium)是葡聚糖的聚陰離子衍生物,喂食果蠅可造成腸道損傷,促使腸道干細胞增殖補充受損細胞。利用5%DSS喂食果蠅2天,發(fā)現CR43282敲除果蠅中腸道干細胞的數目與對照相比是減少的,表明在果蠅腸道再生條件下,CR43282影響腸道干細胞的增殖。根據lnc RNA敲除果蠅構建原理繪制染色體定位圖,發(fā)現CR43282突變果蠅株同時敲除了CR43282和CR46040。隨后通過單只果蠅PCR及基因測序證實了該結果。為了反向驗證CR43282和CR46040的功能,我們需要分別過表達CR43282和CR46040,所以構建了CR43282和CR46040轉基因質粒。另一方面,通過PH3染色發(fā)現CR43282/CR46040敲除果蠅株ISC/EB細胞數目的減少是由于ISC的增殖受到抑制,表明腸道再生時CR43282/CR46040參與ISCs的增殖過程。lncRNA對果蠅腸道干細胞的調控還未有過報道,本研究通過對影響果蠅腸道干細胞增殖與分化的lnc RNAs的篩選,為進一步揭示腸道干細胞增殖與分化的調控機理提供了幫助。
【圖文】：

圖 1 lncRNA 篩選策略示意圖。左邊為果蠅腸道干細胞分裂分化示意圖。ISC：腸道干細胞；EB：中間過渡細胞；EC：腸道表皮細胞；EE：腸內分泌細胞；EEP,Pre-EE：EE 細胞的前體細胞。右邊是篩選 lncRNA 的簡要策略，，以及篩選出陽性 lncRNA的后續(xù)研究策略。

圖 2.1 X 染色體整合株構建流程圖2.2.2 Ⅱ染色體整合株建立方法建立Ⅱ染色體整合株 esgGal4>lncX;UAS-DsRed，需要建立兩為 lncX;UAS-DsRed/TSTL 和 esgGal4,lncX/TSTL，然后二者雜
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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1 Yanfen Lu;Zhouhua Li;;No Intestinal Stem Cell Regeneration after Complete Progenitor Ablation in Drosophila Adult Midgut[J];Journal of Genetics and Genomics;2015年02期

本文編號：2634208