【摘要】：金屬元素是生物的正常生存所必需的。在金屬缺乏的環(huán)境中,細菌普遍采取的應對策略是首先在細胞內(nèi)合成金屬載體,并將金屬載體分泌到胞外以螯合胞外游離金屬離子,再進一步通過外膜受體轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)實現(xiàn)在金屬匱乏的環(huán)境中對金屬離子的攝取。鋅(Zn)對于所有的生物都是非常重要的微量元素,鋅在細菌中可以與蛋白質(zhì)結(jié)合幫助蛋白形成必要的結(jié)構(gòu)以完成其相應的功能,鋅還可以在金屬酶中作為輔助因子,參與金屬酶的催化作用。在細菌的致病性方面,維持細菌體內(nèi)鋅離子的穩(wěn)態(tài)對于細菌在宿主體內(nèi)的成功定植、繁殖非常重要。細菌可以通過鋅離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)維持細胞在各種環(huán)境中鋅離子的平衡。本研究以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作為研究對象,銅綠假單胞菌是一種條件致病菌,是醫(yī)院內(nèi)最常見的感染菌種之一。銅綠假單胞菌主要會引起燒傷病人的感染、插入導尿管或外科手術(shù)病人的感染,囊性纖維化癥(CF)病人肺部感染的主要菌群也為銅綠假單胞菌,同時,銅綠假單胞菌也容易引起呼吸道、泌尿系統(tǒng)的感染和引起菌血癥病。由于銅綠假單胞菌具有廣泛的抗生素耐藥性,因此對于治愈由銅綠假單胞菌引起的疾病非常困難。本研究圍繞著銅綠假單胞菌PAO1中鋅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的操縱子cntRLMN和調(diào)控蛋白Zur展開研究。首先利用相關(guān)文獻分析,發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌操縱子cntRLMN與負責合成多功能金屬載體staphylopine的金黃色葡萄球菌操縱子SacntKLM同源,為了驗證基于此的推測,在已經(jīng)敲除鋅離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)ZnuBC的突變株基礎(chǔ)上通過同源重組的方法獲得了Δzur、BCR(ΔznuBCΔcntR)、BCL(ΔznuBCΔcntL)、BCN(ΔznuBCΔcntN)等突變株,并利用pME6032質(zhì)粒構(gòu)建了這些突變株的遺傳互補菌株,利用pMini-CTX∷lacZ獲得了啟動子的轉(zhuǎn)錄融合報告菌株,使用pET28a構(gòu)建了蛋白表達純化的載體和菌株。先前的文獻已經(jīng)表明cnt操縱子的啟動子上存在Zur調(diào)控蛋白的假定結(jié)合位點,因此通過β-半乳糖苷酶活性的測定,本研究得出cnt操縱子受到Zur蛋白的負調(diào)控。通過凝膠遷移阻滯實驗(EMSA),本研究得出了Zur能夠直接結(jié)合PcntR'啟動子。通過對不同鋅離子濃度下的生長曲線分析表明,ZnuBC和CntL、CntR、CntN均參與銅綠假單胞菌鋅離子的攝取,它們的功能存在互補性,由于ZnuBC是已知的鋅離子攝取系統(tǒng),因此CntRLMN是另一種獨立的鋅離子攝取系統(tǒng)。通過對外源添加細胞提取物的生長曲線分析和結(jié)合文獻報道,本研究得知CntL可能通過控制合成鋅載體參與鋅離子的攝取;CntR是外膜受體,將外界的鋅載體轉(zhuǎn)運至周質(zhì)空間;CntN是一個內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白,通過將胞內(nèi)的鋅載體轉(zhuǎn)運至周質(zhì)空間來參與銅綠假單胞菌的鋅離子的攝取。通過互補cntR、cntL、cntN和zur基因恢復了cnt操縱子鋅離子的攝取功能及Zur蛋白的調(diào)控功能,再次證明了cnt操縱子參與銅綠假單胞菌中鋅離子的攝取和Zur蛋白對cnt操縱子的調(diào)節(jié)控制。其次,通過β-半乳糖苷酶活性的檢測得出了自身基因的突變不會影響cnt操縱子的表達,并且通過重金屬離子的毒性篩查實驗表明cnt操縱子不影響銅綠假單胞菌對重金屬的耐受力。最后本研究通過大蠟螟幼蟲侵染實驗表明銅綠假單胞菌的cnt操縱子突變菌株對大蠟螟幼蟲的毒性顯著降低。最終,本研究提出了cnt介導鋅離子轉(zhuǎn)運的假定分子模型,簡述為銅綠假單胞菌的CntL在細胞質(zhì)中合成的zincophore通過CntN轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間,再通過一未知的外膜通道蛋白分泌到胞外,進而螯合胞外的鋅離子形成zincophore-Zn~(2+)復合物,該復合物進一步通過外膜受體CntR和一未知的內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運回細胞質(zhì),鋅離子則在胞內(nèi)積累并與調(diào)控蛋白Zur結(jié)合而抑制cntRLMN操縱子的表達。通過本實驗,我們不僅解決了銅綠假單胞菌中鋅離子攝取中的一些問題,而且還為銅綠假單胞菌中鋅離子攝取系統(tǒng)的研究帶來了新的進展,為靶向鋅離子攝取系統(tǒng)的新型抗菌藥物的開發(fā)提供了新的靶點。
【圖文】：

圖 1-1 不同細菌 staphylopine 生物合成基因簇的比較Figure 1-1 Comparison of staphylopine biosynthetic gene clusters of different bacteria1.3 本研究的內(nèi)容和意義本研究是以模式病原細菌銅綠假單胞菌為研究材料，，以銅綠假單胞菌中鋅離子攝取的途徑為研究對象，以ΔznuBC 為出發(fā)菌株，通過目的基因突變株、遺傳互補菌株、lacZ 染色體轉(zhuǎn)錄融合報告菌株的構(gòu)建，EMSA，β-半乳糖苷酶的測定，生長曲線分析等手段研究了 Zur 蛋白對 cnt 操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，Zur 蛋白與 cnt 啟動子的體外直接結(jié)合，及對 cnt 操縱子上 cntR、cntL、cntN 等基因的鋅離子攝取功能進行了分析和鑒定，同時也研究了自身基因的突變是否影響 cnt 操縱子的表達和 cnt 操縱子是否參與銅綠假單胞菌中其它重金屬離子的攝取。最終，通過構(gòu)建大蠟螟幼蟲的侵染模型來研究 cnt 操縱子對銅綠假單胞菌毒力發(fā)揮的影響。通過本項研究，我們不僅將回答當前銅綠假單胞菌中鋅離子攝取研究領(lǐng)域所存

本研究的主要技術(shù)路線圖
【學位授予單位】：延安大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R378

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 沈健;馮晨;林允照;鄭文華;顧華;蔣錦琴;馮磊;;銅綠假單胞菌生物膜形成機制及耐藥相關(guān)性[J];浙江預防醫(yī)學;2015年01期

2 Kosorok M.R. ,Farrell P.M. ,姜志茹;黏液型銅綠假單胞菌感染的縱向發(fā)展與囊性纖維化患兒肺疾病進展[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘(胃腸病學分冊);2005年06期

本文編號：2634194