【摘要】：目的:克隆并表達(dá)埃及伊蚊(Aedes aegypti)(廣東電白株)Serpin23蛋白,并對其進(jìn)行酶活性檢測,以探討其可能具有的生物學(xué)功能。方法:設(shè)計基因特異性引物,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增埃及伊蚊廣東電白株serpin23基因成熟肽序列,并將其克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1和麥胚無細(xì)胞表達(dá)(Wheat Germ Cell-free)載體pEU-E01-His-TEU-MCS-N2。將測序正確的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Serpin23(rSerpin23)轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL-21(DE3)中后經(jīng)異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá);重組質(zhì)粒pEU-Serpin23(rpEU-Serpin23)按照麥胚無細(xì)胞表達(dá)試劑盒說明書進(jìn)行表達(dá);構(gòu)建pcDNA3.1-Serpin23重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,在DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞及上清。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和免疫印跡(western blotting)進(jìn)行鑒定。鑒定后的蛋白經(jīng)GSTrap~(TM)FF和Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化。采用手工法檢測rSerpin23對人全血部分凝血酶原時間(prothrombin time,PT),凝血酶時間(thrombin time,TT)及凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)的影響。最后采用發(fā)色底物法檢測rSerpin23、rpEU-Serpin23和pcDNA3.1-Serpin23蛋白對胰蛋白酶的抑制作用。結(jié)果:Serpin23序列全長為1254 bp,具有信號肽序列,生物信息學(xué)分析顯示其具有Serpin結(jié)構(gòu)域。PCR擴(kuò)增獲得其成熟肽序列,將其克隆入pGEX-4T-1和pEU-E01-His-TEU-MCS-N2載體,經(jīng)PCR、雙酶切及DNA測序結(jié)果均表明rSerpin23重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示,Serpin23成熟肽序列長1197 bp,編碼399個氨基酸。與網(wǎng)上序列(登錄號:DQ439995)進(jìn)行比對,在第904位置的T堿基突變成C堿基,為同義突變。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒rSerpin23轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得可溶性rSerpin23蛋白;重組質(zhì)粒pEU-Serpin23在麥胚無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中成功的表達(dá)出了rpEU-Serpin23重組蛋白;重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Serpin23轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后在細(xì)胞中檢測到重組蛋白表達(dá)。經(jīng)Western blotting證實獲取的重組蛋白rSerpin23、rpEU-Serpin23和pcDNA3.1-Serpin23是目的蛋白。在1.0μM rSerpin23作用下,PT、TT和APTT分別為13.29 S、15.34 S和36.72 S,均無延時效應(yīng)。此外,酶標(biāo)儀動態(tài)檢測產(chǎn)物吸光度值發(fā)現(xiàn),rSerpin23、rpEU-Serpin2和pcDNA3.1-Serpin23重組蛋白均不能夠抑制胰蛋白酶活性。結(jié)論:三種方法均成功獲得埃及伊蚊(廣東電白株)Serpin23重組蛋白,未檢測到其具有抑制胰蛋白酶的活性。
【圖文】：

圖 1 Serpin23 蛋白的信號肽分析Fig. 1 The signal petide analysis of Serpin23 protein性分析性對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的折疊起著重要作用，通過 ExPASy 的 Proin23 蛋白的疏水性。結(jié)果顯示，Serpin23 蛋白的親水性)值為-0.330，說明該蛋白是個親水性蛋白（如圖 2）。

圖 1 Serpin23 蛋白的信號肽分析Fig. 1 The signal petide analysis of Serpin23 protein2 疏水性分析疏水性對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的折疊起著重要作用，，通過 ExPASy 的 Protscale Serpin23 蛋白的疏水性。結(jié)果顯示，Serpin23 蛋白的親水性平均AVY)值為-0.330，說明該蛋白是個親水性蛋白（如圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R384.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2633455