【摘要】：研究目的:(1)合成中藥小分子牛蒡苷(ARC)的人工抗原。(2)篩選能夠特異性分泌抗牛蒡苷抗體的單克隆細胞株,并制備抗牛蒡苷單克隆抗體。(3)基于獲得的單克隆抗體建立酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA),并對其進行方法學(xué)考察。研究方法:采用依照本實驗需求改進的高碘酸鈉氧化法,制備牛蒡苷的人工抗原(免疫原和包被原)。用薄層色譜法(TLC)以及飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法對以上的合成產(chǎn)物進行鑒定,以確定其偶聯(lián)結(jié)果。而后用合成的人工免疫原免疫小鼠,與等體積弗氏佐劑乳化均勻后背部皮下多點注射,每隔兩周加強免疫一次,以充分誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答。四次免疫后尾尖取血,ELISA法檢測抗血清的效價,評價免疫效果;間接競爭檢測抗血清的特異性。取免疫后小鼠的脾臟制備脾單細胞懸液,采用PEG法將脾細胞與SP2/0雜交瘤細胞融合,篩選可分泌所需特異性抗體的雜交瘤細胞。有限稀釋法進行單克隆化以獲得單克隆細胞株,采用體內(nèi)腹水誘導(dǎo)法完成抗體的擴大生產(chǎn)�；谏a(chǎn)的牛蒡苷單克隆抗體建立間接競爭ELISA檢測方法,考察該方法的特異性、靈敏度、交叉反應(yīng)率、回收率等相關(guān)指標。研究結(jié)果:(1)薄層色譜鑒定和飛行時間質(zhì)譜的結(jié)果說明,合成的產(chǎn)物ARC-BSA和ARC-OVA偶聯(lián)成功;飛行時間質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示,人工抗原合成成功,偶聯(lián)比為6:1。(2)小鼠抗血清效價在1:16000以上,標準競爭抑制曲線表明,血清中的抗體可與ARC產(chǎn)生特異性結(jié)合。取免疫的小鼠脾細胞進行細胞融合,篩選出了能特異性分泌抗ARC抗體的單克隆細胞株。腹水誘導(dǎo)法制備了大量ARC單克隆抗體(3)基于制備的ARC單克隆抗體,建立相應(yīng)的ELISA分析法。包被原ARC-OVA以1:8000的濃度稀釋,腹水以1:40000的濃度稀釋,得到ARC單克隆抗體的抑制率與線性關(guān)系曲線,回歸方程為:y =-0.2031n(x)+ 2.1102,R2=0.9969。線性范圍為125~3981 ng/mL,半數(shù)抑制率IC50為1466.0ng/mL。方法學(xué)考察結(jié)果顯示,加樣回收率在97.5~107.4%之間(均值為102.2%),板內(nèi)差異4.62%,板間差異8.67%。通過ELISA法測試ARC單抗與它中藥活性成分反應(yīng)的交叉反應(yīng)率。結(jié)果顯示ARC單抗與其他成分的交叉反應(yīng)率均小于0.10%。說明制備的ARC單克隆抗體有良好的特異性。研究結(jié)論及意義:本實驗首次成功合成了 ARC的人工抗原,為ARC單克隆抗體的篩選和制備以及相關(guān)免疫方法的建立奠定基礎(chǔ);首次篩選出ARC的單克隆細胞株;首次制備出了 ARC的單克隆抗體;首次利用生產(chǎn)出的ARC單克隆抗體建立ELISA酶聯(lián)免疫吸附分析方法。本研究為牛蒡苷的檢測提供了一種全新的技術(shù)手段,同時為中藥牛蒡子以及含有牛蒡子的中藥復(fù)方的質(zhì)量控制、物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)代謝與分布、藥理藥效等多方面的研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

逑３．４抗血清中ＡＲＣ抗體靈敏度測定逡逑表２－４為ＡＲＣ－ＢＳＡ免疫小鼠血清中抗體的間接競爭ＥＬＩＳＡ試驗結(jié)果。圖２－１為其逡逑競爭抑制曲線。從結(jié)果可以看出，４只小鼠的抗血清均具有競爭性，都可以特異性識別逡逑牛蒡苷小分子，因此四只老鼠均免疫成功成功。而這其中，２、３號小鼠靈敏度較高，且逡逑線性較好。逡逑表２－４邋ＡＲＣ－ＢＳＡ四只免疫小鼠抗血清的間接競爭試驗結(jié)果逡逑Ｔａｂ．２－４邋Ｉｎｄｉｒｅｃｔ邋ｃｏｍｐｅｔｉｖｅ邋ＥＬＩＳＡ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＡＲＣ－ＢＳＡ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ｍｉｃｅ邋ｓｅｒｕｍ．逡逑￣線性方程逡逑￣Ｉ邐Ｙ＝邋－０．０９２１ｎ（ｘ）＋邋１．７００８邐０．９５３８逡逑２邐Ｙ＝－０．０８１１ｎ（ｘ）＋邋１．１７５５邐０．９８２４逡逑３邐Ｙ＝－０．０９８１ｎ（ｘ）＋邋１．１６４３邐０．９６９４逡逑４邐Ｙ＝邋－０．０６６１ｎ（ｘ）邋＋邋１．０４３６邐０．９７６４逡逑１．４邋ｒ逡逑ＡＲＣ＿１邋ａｎｔｉ邋ｓｅｒｕｍ逡逑Ｔ邐＃邋ＡＲＣ－２邋ａｎｔｉ邋ｓｅｒｕｍ逡逑１．２邋ｆ＂＂１邐邐邐邋—？—ＡＲＣ－３邋ａｎｔｉ邋ｓｅｒｕｍ逡逑■■■Ａ—ＡＲＣ－４邋ａｎｔｉ邋ｓｅｒｕｍ逡逑。６：邋＼＼逡逑０．４邐１逡逑０．２邋！邐丨邐：邐＇邐１邐邐？邐！逡逑１邋１０邋１００邋１０００邋１００００邋１０００００邋１００００００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋

３．７陽性雜交瘤細胞的篩選結(jié)果逡逑細胞融合１４天左右顯微鏡下觀察融合效果，４塊細胞培養(yǎng)板共３５２孔中有雜交瘤克逡逑隆細胞生長的孔為２９２個，融合率達到８２．９％邋；邋ＥＬＩＳＡ法篩初篩陽性孔，圖２－２為其中逡逑一塊細胞培養(yǎng)板的陽性篩選結(jié)果，，藍色指示為陽性孔。繼而采用間接競爭ＥＬＩＳＡ法考逡逑察陽性孔上清液的競爭性，排除假陽性孔，進一步確定陽性孔。測得陽性突出且有競爭逡逑的孔有邋１Ｇ１、１Ｈ５、１Ｂ７、２Ｃ６、２Ｅ１０、２Ａ８、３Ｂ５、３Ｅ８、４Ｆ７、４Ｄ３邋等邋１０邋個。陽性率為逡逑３．４２％。通常情況下陽性率在３％－７％的范圍內(nèi)屬于正常，因此本次融合正常。逡逑＿＿＿－＿＿｜￣￣－￣￣｜￣＾￣４｜＂＂＂＂＂５￣６￣￣￣７￣８＾＂＂＂＂＂＂９￣１０￣￣￣￣Ｕ￣逡逑Ａ邋｜邋２．６４７邐ｉ邐２．６９３邐ｊ邐２，６４２邋ｊ邋０．１９３邐：２．７０９邋［邋０．１８７邐０．１５２邐６．１８１邐０．１７６邐０．１７４邐０．１７８逡逑Ｂ邋Ｉ邋２．５９邐０．１６３邐０．１４５邐０．１５８邐０．１５？邐［邋２．６５７邋ｊ邋0＿１４邐０．１４５邐０１４１邐０．１５逡逑Ｃ邋
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2633366