【摘要】：眾所周知,病毒是一種可以在人其它生物體間傳播并感染生物體的微小病原體。近些年來(lái),再發(fā)和新發(fā)由病毒導(dǎo)致的流行性疾病時(shí)常發(fā)生,嚴(yán)重威脅人類的身體健康和生命財(cái)產(chǎn)安全。牛與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系尤為緊密,尤其在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的東北林業(yè)地區(qū)。牛在飼養(yǎng)過(guò)程中易受到攜帶致病病毒的蚊蟲(chóng)叮咬,以及攝入被相關(guān)致病病毒污染的水源和飼料。若感染牛的致病病毒對(duì)牛甚至是人的健康具有威脅,則牛便會(huì)成為污染源。因此,熟悉和探明東北林區(qū)牛以及其密切接觸的人的血中現(xiàn)已掌握或尚未查明的病毒具有至關(guān)重要的意義!傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)方法在面對(duì)未知病毒和新發(fā)病毒檢測(cè)方面具有較大的局限性�；诙鷾y(cè)序技術(shù)的病毒宏基因組學(xué)(Viral Metagenomics)的出現(xiàn)很好的解決了這一問(wèn)題。此研究方法直接以樣本中所存在的所有病毒核酸序列為研究對(duì)象,對(duì)樣本中已知和未知的病毒具有較好的檢出性。該技術(shù)出現(xiàn)和興起為挖掘和檢測(cè)新型病毒序列及對(duì)新發(fā)病毒性傳染病的流行預(yù)警提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。為了探究和掌控東北林區(qū)牛及其密切接觸的人的血液中病毒群落的組成情況,以及挖掘新型的潛在致病性病毒,本研究運(yùn)用了病毒宏基因組學(xué)的方法對(duì)東北林區(qū)養(yǎng)殖的牛及其密切接觸的人的血液樣品進(jìn)行了研究。本研究的主要內(nèi)容如下:(一)牛血液病毒組分析東北林區(qū)牛血液中的病毒群落的組成包括:未分類病毒科(None)、藻類去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)12.64%、Mimiviridae病毒科4.44%、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)3.22%、圓環(huán)病毒科(Circoviridae)2.22%、痘病毒科(Poxviridae)1.88%、皰疹病毒科(Herpesviridae)1.11%、虹彩病毒科(Iridoviridae)1.01%、Marseilleviridae病毒科0.86%、桿狀病毒科(Baculoviridae)0.55%、聯(lián)體病毒科(Geminiviridae)0.29%、Alloherpesviridae病毒科0.23%、Bicaudaviridae病毒科0.22%、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)0.18%、Sphaerolipoviridae病毒科0.13%、腺病毒科(Adenoviridae)0.13%、其他病毒科(Others)1.25%。牛血液病毒群落的分析顯示:(1)東北林區(qū)牛血液中病毒群落的組成呈現(xiàn)出病毒種類的多樣性。(2)在所有病毒中,未分類病毒所占比重最大,達(dá)到了69.65%,構(gòu)成了東北林區(qū)牛血液病毒群落的主體。其次是藻類去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)12.64%、Mimiviridae病毒科4.44%、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)3.22%以及圓環(huán)病毒科(Circoviridae)2.22%。(3)這5個(gè)病毒文庫(kù)中,含有多種屬于如小RNA病毒科(Picornaviridae)、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、環(huán)狀病毒科(Circoviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)等具有感染哺乳動(dòng)物能力的病毒。(二)人血液病毒組分析結(jié)果顯示:在東北林區(qū)與牛密切接觸的人的血液中的病毒群落的組成包括:指環(huán)病毒科(Anelloviridae)、肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(HERV)。人血病毒群落分析提示:(1)人血液中病毒群落的組成種類相對(duì)較少(2)病毒DNA文庫(kù)Forest05發(fā)現(xiàn)了三個(gè)不同種屬的人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(HERV)核酸序列(3)病毒DNA文庫(kù)Forest06發(fā)現(xiàn)一完整乙肝病毒核酸全基因組(三)東北林區(qū)牛及其密切接觸的人的血液病毒群落的比較東北林區(qū)牛及其密切接觸的人的血液病毒群落之間的組成差異較大,二者病毒群落見(jiàn)并無(wú)相關(guān)性,在牛血液病毒群落中存在的病毒幾乎不存在于人的血液中。(四)未知新型病毒的鑒定及遺傳特征分析(1)新型Circovirus在東北林區(qū)牛的血液中,發(fā)現(xiàn)了三個(gè)新型的完整Circovirus病毒基因組。分別命名為Bvch001、Bvch002、Bvch005。此類病毒是目前僅能夠感染鳥(niǎo)類和豬的環(huán)形單鏈DNA病毒,是否具有感染牛和在牛的體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的能力尚無(wú)明確報(bào)道。本研究通過(guò)反向PCR的方法,從文庫(kù)5和文庫(kù)4分別得到了Bvch001和Bvch002這兩個(gè)病毒全基因組核酸序列,基因全長(zhǎng)分別為1881nt和2926nt;Bvch003在文庫(kù)中已有其完整基因組。對(duì)這三個(gè)病毒全基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),Bvch002包含復(fù)制蛋白基因(Rep)和衣殼蛋白基因(Cap)并且方向相同;Bvch002和Bvch005的兩個(gè)復(fù)制蛋白基因(Rep)和衣殼蛋白基因(Cap)則方向相反。利用病毒的保守復(fù)制蛋白(Rep)與Gen Bank基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTp蛋白比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn),Bvch001和兩支來(lái)自大猩猩的小環(huán)形病毒(KP233191 and KP233192)具有55%的相似度;Bvch002和來(lái)自蜻蜓(KM598397)的環(huán)狀樣病毒(circovirus-like virus)具有最高的相似度,達(dá)到38%;Bvch005和來(lái)自牛的糞便相關(guān)的環(huán)狀病毒(Circovurs)具有高達(dá)38%的相似度。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這兩株Circovirus病毒在東北林區(qū)牛的血液中的確存在,本研究基于在牛的血液中發(fā)現(xiàn)的這三株Circovirus病毒的核酸序列分別設(shè)計(jì)了針對(duì)這三支病毒的保守復(fù)制蛋白(Rep)基因PCR引物,對(duì)80份東北林區(qū)牛血液樣本進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示:在三個(gè)樣本檢測(cè)出Bvch001病毒核酸序列并測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn),這3個(gè)測(cè)序結(jié)果相似度大于99.3%;Bvch002和Bvch005分別都在1份樣本中被檢測(cè)出相應(yīng)的核酸序列,隨后對(duì)檢測(cè)出的核酸序列進(jìn)行測(cè)序并與原始病毒文庫(kù)中的病毒核酸進(jìn)行比對(duì),測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示和兩個(gè)原始circovirus REP基因核酸序列完全吻合。隨后利用這3支毒株的保守的復(fù)制蛋白(Rep)氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,它們都類聚到環(huán)狀病毒Circovirus。以上結(jié)果顯示這兩支病毒屬于新型的環(huán)狀病毒Circovirus。(2)新型Gemycircularviruses該病毒是新發(fā)的能夠在人以及其他動(dòng)物,甚至是環(huán)境樣本中存在的單鏈環(huán)形DNA病毒。在牛的血液中,發(fā)現(xiàn)了兩株新型的gemycircularvirus,分別命名為“BGmv001”和“BGmv002”,基因組全長(zhǎng)分別為2192nt和2926nt�；蛐蛄蟹治鲲@示這兩個(gè)病毒的基因組包含兩個(gè)方向相反的基因,分別編碼復(fù)制蛋白(Rep)和衣殼蛋白(Cap)這兩種蛋白,而且都不含有內(nèi)含子(intron)區(qū)域。根據(jù)病毒相對(duì)保守的的復(fù)制蛋白(Rep)進(jìn)行BLASTp蛋白序列比對(duì)分析之后發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)病毒毒株分別和來(lái)自蜻蜓的gemycircularvirus以及來(lái)自鳥(niǎo)類糞便的gemycircularvirus具有56%和36%的相似度。本研究根據(jù)牛血液樣本發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)gemycircularvirus REP基因的核酸序列分別設(shè)計(jì)引物,對(duì)80份牛的血液進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示BGmv001和BGmv002都在兩份樣本中發(fā)現(xiàn)了其基因序列,對(duì)發(fā)現(xiàn)的BGmv001和BGmv002的兩條核酸序列進(jìn)行測(cè)序。BGmv001兩條290bp長(zhǎng)的核酸序列測(cè)序結(jié)果相似度為99%;基于BGmv002的兩條280bp長(zhǎng)的核酸序列測(cè)序結(jié)果相似度為98%。利用這兩支病毒的保守蛋白復(fù)制蛋白(Rep)氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,它們都和gemycircularvirus家族類聚,以上結(jié)果顯示這兩個(gè)病毒屬于新的gemycircularvirus。(4)新型Bovine parvovirus牛細(xì)小病毒bovine pavovirus是一類小型的線性DNA病毒,可導(dǎo)致乳牛腹瀉和成年牛呼吸道和生殖系統(tǒng)疾病。本研究在牛的血液中,發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)分別為Bovine parvovirus 2和Bovine parvovirus 3的兩種新型牛細(xì)小病毒,分別命名為BPV2和BPV3。牛細(xì)小病毒包含兩段排列方向相同的基因,分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)和結(jié)構(gòu)蛋白(VP1)。對(duì)BPV2和BPV3的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)和結(jié)構(gòu)蛋白(VP1)分別進(jìn)行BLASTp蛋白氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn),BPV2的NS蛋白的氨基酸序列和Gen Bank database基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的3個(gè)BPV2的NS蛋白氨基酸序列具有高達(dá)96%-98%的相似度,但是VP1蛋白的氨基酸序列卻只有84%-86%的相似度。BPV3的NS蛋白氨基酸序列、VP1蛋白氨基酸序列與Gen Bank database基因數(shù)據(jù)庫(kù)中唯一一個(gè)BPV3的NS、VP1有著分別高達(dá)96%和97%的序列相似度。根據(jù)以上結(jié)果本研究認(rèn)為BPV2是新型的牛細(xì)小病毒bovine parvovirus。結(jié)論:(1)利用病毒宏基因組學(xué)方法掌握了牛血液及其相關(guān)人的血液病毒群落的組成;(2)牛血液病毒群落的組成呈現(xiàn)多樣性;人血液病毒群落較為單一(3)從牛的血液中發(fā)現(xiàn)了2支新型的gemycircularvirus、3支新型的circovirus、一支新型的parvovirus。
【圖文】：

15圖2.1 index primer 示意圖Fig.2.1 index primer Schematic diagram（3）反應(yīng)完畢后用1%濃度的瓊脂糖凝膠對(duì)其進(jìn)行電泳檢情況。2.1.10 文庫(kù)的純化本步驟的目的是去除文庫(kù)中擴(kuò)增產(chǎn)生的引物二聚體，使樣毒核酸，在操作前按照病毒文庫(kù)純化前電泳圖按比例吸取各45μl 體積的病毒 DNA 文庫(kù)混合物，，嚴(yán)格按照如下步驟執(zhí)行（1） 吸取 45μl PCR 文庫(kù)產(chǎn)物混合物到新的 1.5ml 的純凈

圖 2.3 牛血及人血的病毒 DNA 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)Fig.2.3 The quality detection of viral DNA library from Blood of Cattle and human.2.2.1.2 病毒文庫(kù)的 Bioanalyzer 檢測(cè)經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)后符合要求的文庫(kù)，運(yùn)用 Agilent bioanalyzer 檢測(cè)器 DNA 長(zhǎng)度的范圍分布情況以及 DNA 的濃度。檢測(cè)結(jié)果如下圖 2.4 所示，結(jié)果說(shuō)明文庫(kù)內(nèi)的 DNA 長(zhǎng)度的分布及 DNA 的濃度均已達(dá)到 Miseq 的測(cè)序要求，并且可以上機(jī)測(cè)序。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373;S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2632714