【摘要】：第一部分腸道病毒71型感染對(duì)小鼠大腦與腦干肉堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶2表達(dá)和作用的影響 目的：肉堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶(Carnitine palmitoyltransferase, CPT)系統(tǒng)在長(zhǎng)鏈脂肪酸β-氧化中起著重要作用,也是線粒體脂肪酸氧化產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵組成部分。長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體的限速步驟是在線粒體外膜CPT1的催化作用下,通過轉(zhuǎn)脂作用把脂肪酰輔酶A轉(zhuǎn)變成�；鈮A,并且在CPT1的作用下進(jìn)入線粒體基質(zhì)；在線粒體內(nèi)膜CPT2把�；鈮A轉(zhuǎn)換成酰基輔酶A,然后進(jìn)入β-氧化途徑。在本實(shí)驗(yàn)中我們研究腸道病毒71型(Entero virus71, EV71)感染對(duì)小鼠大腦和腦干肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶2表達(dá)和作用的影響,探討EV71相關(guān)腦炎的病理生理機(jī)制。 方法：1日齡ICR小鼠8窩(48-80只),每只小鼠腹腔內(nèi)注射含有EV71(TCID50=107.5)的DMEM培養(yǎng)基O.1ml,觀察小鼠感染后癥狀,并分別于病毒接種后5d、10d、15d各用乙醚安樂死6只感染組小鼠和6只0d(未接種病毒前)小鼠,取出大腦、腦干。應(yīng)用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠腦組織中EV71病毒載量；電子顯微鏡檢測(cè)線粒體；應(yīng)用免疫組織化學(xué)(Immune histochemical, IHC)、Westblot、熒光定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠大腦、腦干CPT2的表達(dá)；檢測(cè)大腦和腦干細(xì)胞的CPT2酶活性和ATP水平。 結(jié)果：EV71感染小鼠后5天,在大腦檢測(cè)到EV71RNA拷貝數(shù)為5.334±0.30log1ocopies/mg tissue,腦干為6.20±0.19log10copies/mg tissue;然而,隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),EV71RNA拷貝數(shù)逐漸降低。在感染后5天,電鏡顯示線粒體腫脹、線粒體嵴和線粒體膜斷裂、變短或消失；CPT2表達(dá)下降,CPT2酶活性減低；ATP水平明顯下降；而在感染后的10-15天,這些變化逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)。 結(jié)論：我們的研究資料顯示：EV71感染損傷了腦組織的線粒體,引起CPT2的表達(dá)減少,導(dǎo)致CPT2酶活性降低、ATP生成減少。能量代謝障礙可能加速或加重了EV71腦炎發(fā)展,可能與腦炎的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究從能量代謝障礙方面闡述了EV71腦炎的病理生理機(jī)制。 第二部分PSGL-1在腸道病毒71型感染小鼠的表達(dá)和作用 目的：通過檢測(cè)EV71感染小鼠不同組織中P選擇素糖蛋白配體-1(Mouse P-selectin glycoprotein ligand-1, mPSGL-1)的表達(dá),探討P選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)在EV71感染中的作用。 方法：1日齡ICR小鼠11窩(66-110只)隨機(jī)分為2組,實(shí)驗(yàn)組8窩(48-80只)每只小鼠腹腔內(nèi)注射含有EV71(TCID50=107-5)的DMEM培養(yǎng)基0.1ml,另3窩(18-30只)為對(duì)照組,每只小鼠腹腔注射無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基0.1ml。觀察小鼠感染后癥狀,并分別于0d(接種病毒前)、病毒接種后、4d、8d、12d各用乙醚安樂死6只感染組小鼠與6只對(duì)照組小鼠,取出大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肺臟。應(yīng)用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠腦組織中EV71病毒載量；應(yīng)用免疫組織化學(xué)、Westblot、熒光定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肺臟mPSGL-1的表達(dá)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的表達(dá)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測(cè)大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肺臟的促炎細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis fector-alfa, TNF-a)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-lbeta, IL-1β)含量。分析EV71感染小鼠不同組織的mPSGL-1的相對(duì)表達(dá)量對(duì)CD4+、CD8+、巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響,以及與促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β產(chǎn)生水平的關(guān)系。 結(jié)果：EV71感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒載量較心臟和肺臟的病毒載量增多；mPSGL-1在EV71感染小鼠的組織中表達(dá)增加,在感染后一定時(shí)間內(nèi),mPSGL-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相對(duì)表達(dá)量比在心臟或/和肺臟的相對(duì)表達(dá)量明顯增多,尤其在腦干和大腦增多更為明顯。在所被測(cè)組織中的CD4+、CD8+、巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)染色顯示也增多；另外,在EV71感染小鼠所被測(cè)組織中的mPSGL-1相對(duì)表達(dá)量與TNF-α、IL-6和IL-1β產(chǎn)生量有相關(guān)性：在感染后的4天,大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肺臟的mPSGL-1相對(duì)表達(dá)量與TNF-α、IL-6和IL-1β產(chǎn)生量成負(fù)相關(guān)；在感染后8天,除了心臟和肺臟的mPSGL-1相對(duì)表達(dá)量與TNF-a產(chǎn)生量未有相關(guān)性外,大腦、小腦、腦干、脊髓mPSGL-1的相對(duì)表達(dá)量與TNF-α、IL-6和IL-1β產(chǎn)生量仍成負(fù)相關(guān)；在感染后12天在所有被測(cè)組織未再有相關(guān)性。 結(jié)論：在EV71感染時(shí),局部組織的mPSGL-1表達(dá)增加,可能在白細(xì)胞募集與宿主的先天性固有免疫反應(yīng)中起著重要作用。 第三部分SCARB2在腸道病毒71型感染小鼠的表達(dá)與促炎細(xì)胞因子的關(guān)系 目的：在感染性疾病時(shí),清道夫受體(Scavenger receptor class B, member2, SCARB2)參與早期的先天性固有免疫反應(yīng)；因此,本研究探討腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)感染小鼠時(shí),小鼠清道夫受體(mouse SCARB2, mSCARB2)在不同組織的表達(dá)和作用。 方法：1日齡ICR小鼠13窩(78-130只)隨機(jī)分為2組,感染組10窩(60-100只)每只小鼠腹腔內(nèi)注射含有EV71(TCID50=107.5)的DMEM培養(yǎng)基0.1ml,另3窩(18-30)只為對(duì)照組,每只小鼠腹腔注射無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基0.1ml。觀察小鼠感染后癥狀,并分別于病毒接種后2d、4d、6d、8d、12d各用乙醚安樂死6只感染組與對(duì)照組小鼠,取出大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肺臟。應(yīng)用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠腦組織中EV71病毒載量；應(yīng)用免疫組織化學(xué)、Westblot、熒光定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肺臟SCARB2的表達(dá)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測(cè)小鼠大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肺臟的促炎細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis fector-alfa, TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、白細(xì)胞介素-1β (Interleukin-lbeta, IL-1β)含量。分析EV71感染小鼠不同組織的SCARB2相對(duì)表達(dá)量與細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量的關(guān)系。 結(jié)果：在EV71感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒載量較心臟和肺臟的病毒載量增多。在感染后一定時(shí)間段內(nèi),SCARB2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相對(duì)表達(dá)量較心臟或/和肺臟的相對(duì)表達(dá)量明顯升高,尤其在腦干和大腦。另外,在EV71感染小鼠的不同組織的TNF-α、IL-6和IL-1p產(chǎn)生量與SCARB2相對(duì)表達(dá)量有相關(guān)性：在感染后4天、8天,大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肺臟SCARB2的相對(duì)表達(dá)量與TNF-α、IL-6和IL-1p含量成正相關(guān),感染后12天未再有相關(guān)性。 結(jié)論：在EV71感染時(shí),小鼠局部組織的SCARB2表達(dá)增加,可能在調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生中起著重要作用,尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
【圖文】：

Figure 1圖1. 一日齡ICR小鼠經(jīng)腹腔接種感染EV71的臨床表現(xiàn)。感染EV71小鼠的臨床表現(xiàn)被觀察到感染15天，存活率（A)，臨床疾病得分（B)。結(jié)果是三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. BrCr株EV71在感染小鼠大腦和腦干的病毒載量20

圖2.經(jīng)腹腔接種感染EV71的ICR小鼠不同組織的病毒載量。一日齡ICR小鼠在0天（EV71感染前）和小鼠經(jīng)腹腔接種EV71在感染后5、10、15天使用乙醚吸入法麻醉小鼠，安樂處死（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死6只），用突光定量RT-PCR檢測(cè)肺臟（A)、心臟（B)、脊髓（C)、小腦（D)、大腦（E)、腦干（F)組織的病毒載量。每個(gè)標(biāo)本的病毒載量重復(fù)三次，表示為（means±SEM)。3.線粒體電子顯微鏡小鼠感染EV71后，電子顯微鏡顯示，在感染后5天，大腦、腦干的線粒體明顯腫脹，部分線粒體外膜受損，線粒體基質(zhì)清淡，線粒體嵴變短或消失（圖3A，E)。在感染后10天，線粒體腫脹減輕，受損的線粒體膜和線粒體嵴部分恢復(fù)（圖3B，F(xiàn)),在感染后的15天，，線粒體無(wú)腫脹，受損的線粒體膜和線粒體嵴完全恢復(fù)，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別（圖3C,D,G,H)。這些結(jié)果提示小鼠感染EV71后，急性期線粒體受損，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，線粒體受損漸恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2630878