【摘要】：目的：運(yùn)用piggyBac system篩選在干細(xì)胞中能啟動基因表達(dá)的高效啟動子，選擇合適的啟動子應(yīng)用于猿腎病毒40大T抗原（SV40Tag）基因的表達(dá)，建立永生化的人尿源性干細(xì)胞（urine derived stem cell，USC）。通過對永生化尿源性干細(xì)胞的生物學(xué)鑒定，明確其干細(xì)胞分化潛能，并通過骨形成蛋白（BMP9）誘導(dǎo)分化，進(jìn)一步明確永生化尿源性干細(xì)胞具有多向分化潛能，為組織工程學(xué)及再生醫(yī)學(xué)提供新型的穩(wěn)定的細(xì)胞來源。 方法：運(yùn)用piggyBac轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)構(gòu)建并比較帶有不同啟動子的質(zhì)粒，用紅色熒光蛋白（RFP）和螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase Fluc）作為報告基因，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。通過RFP表達(dá)強(qiáng)度，F(xiàn)luc定量檢測及流式細(xì)胞技術(shù)，篩選在干細(xì)胞中穩(wěn)定高效表達(dá)的啟動子。利用該啟動子構(gòu)建帶SV40Tag基因表達(dá)的質(zhì)粒，將SV40Tag基因質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒（transposase）共轉(zhuǎn)染至臨床分離的人尿源性干細(xì)胞中。潮霉素（Hygromycin）篩選后陽性細(xì)胞克隆并連續(xù)傳代，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及增殖情況，RT-PCR，免疫熒光等檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生物學(xué)特性，細(xì)胞裸鼠皮下注射檢測其安全性。運(yùn)用BMP9誘導(dǎo)成骨分化，通過體外細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）染色、茜素紅染色（Alizarin-S staining）、油紅O（Oil-red staining）染色、微團(tuán)細(xì)胞培養(yǎng)（Micro Mass）等特異性染色檢測其成骨、成軟骨及成脂分化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步利用Micro-CT，病理切片染色等檢測尿源性干細(xì)胞在BMP9誘導(dǎo)下具有多向分化功能。 結(jié)果：通過RFP熒光顯示，F(xiàn)luc及流式細(xì)胞定量檢測，hEFH啟動子在干細(xì)胞系中表達(dá)外源基因能力明顯強(qiáng)于其他啟動子，運(yùn)用hEFH啟動SV40Tag基因在尿源性干細(xì)胞中表達(dá)，篩選獲得的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，即永生化尿源性干細(xì)胞（immorterlized urine derived stem cell，iUSC），增殖能力強(qiáng)，能連續(xù)傳代培養(yǎng)。RT-PCR證實(shí)iUSC表達(dá)SV40Tag基因，而用翻轉(zhuǎn)重組酶（Flippers recombination enzyme Flp）處理iUSC可敲除RFT-SV40Tag基因而逆轉(zhuǎn)永生化。應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測該細(xì)胞株表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73、CD44、CD90(Thy-1)、CD29(Integrin)、CD105(Endoglin)、CD166（ALCAM）、BMPR II、SSEA4、CD117、CD133。應(yīng)用BMP9誘導(dǎo)iUSC分化，細(xì)胞堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、油紅O染色等顯示該細(xì)胞向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)染細(xì)胞裸鼠皮下及肌肉接種，4周后無腫瘤形成，通過Micro-CT及病理切片染色等顯示該細(xì)胞在BMP9誘導(dǎo)下，在體內(nèi)具有良好的成骨成軟骨及部分成脂多向分化潛能。 結(jié)論：運(yùn)用piggyBac system成功篩選出適合于干細(xì)胞基因表達(dá)的啟動子hEFH，并用該啟動子通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建SV40Tag永生化尿源性干細(xì)胞，生物學(xué)鑒定該細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，利用BMP9誘導(dǎo)分化，在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)該細(xì)胞具有成骨、成脂、成軟骨分化功能，進(jìn)一步證實(shí)了永生化人尿源性干細(xì)胞的多分化潛能，可以進(jìn)一步誘導(dǎo)分化用于泌尿生殖系統(tǒng)的損傷修復(fù)，并為組織工程學(xué)及再生醫(yī)學(xué)的體外研究和發(fā)展應(yīng)用提供了安全穩(wěn)定的細(xì)胞來源。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文2 結(jié)果2.1 構(gòu)建帶有 RFP 及 Fluc 報告基因的不同啟動子質(zhì)粒運(yùn)用 piggyBac 轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng) pMPB 質(zhì)粒作為基礎(chǔ)質(zhì)粒，，該基礎(chǔ)質(zhì)粒帶有 PB-TR，piggyBac 轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列，核心絕緣子， BSD 篩選擇標(biāo)記序列，SV40 多聚 A 信號等序列。在 pMPB 基礎(chǔ)質(zhì)粒上克隆進(jìn) RFP 報告基因及 Fluc 報告基因，并以 6 種常用的啟動子分別啟動表達(dá)相應(yīng)報告基因。（如圖 1）

圖 2 表達(dá)不同啟動子的 HEK293 及 iMEF 細(xì)胞中 mRFP 的表達(dá)情況gure 2. Verification of the piggyBac vector-mediated stable integrations in HEK-293 cellsEFs. Stable HEK-293 (a) and iMEF (b) lines were established using the six promoter vecd pMPB empty vector (EV) as described in Methods. Genomic DNA was isolated from tines, and subjected to touchdown PCR analysis using the primer pair specific for mRFPFLuc (not shown). GAPDH was used to normalize the genomic DNA level used in the PCanalysis.4 HEK293 細(xì)胞中 CMV 啟動子啟動效果最強(qiáng)，而在 iMEF 細(xì)胞中hEFH 啟動子啟動效果最強(qiáng)前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明 RFP 的拷貝數(shù)在 6 種啟動子的 HEK293 細(xì)胞是相同的， 3（A）所示，在熒光顯微鏡下觀察經(jīng)過篩選的穩(wěn)定表達(dá) RFP 的含不同啟動子
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 HUANG Ke;LIU PengFei;LI Xiang;CHEN ShuBin;WANG LiHui;QIN Li;SU ZhengHui;HUANG WenHao;LIU JuLi;JIA Bei;LIU Jie;CAI JingLei;PEI DuanQing;PAN GuangJin;;Neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells generated less autogenous immune response[J];Science China(Life Sciences);2014年02期

2 Farbod Rastegar;Deana Shenaq;Eric R Wagner;Stephanie H Kim;Russell R Reid;Hue H Luu;Rex C Haydon;;Mesenchymal stem cells: Molecular characteristics and clinical applications[J];World Journal of Stem Cells;2010年04期

本文編號：2626294