【摘要】：果膠物質(zhì)是半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵聚合而成的多糖鏈，廣泛存在于植物初生細(xì)胞壁中。果膠酶是一系列以水解果膠物質(zhì)為底物的酶類的總稱，在高等植物和微生物中分布甚廣。植物在成熟過程中，果膠酶使植物細(xì)胞壁更緊致松軟，對(duì)植物組織腐敗再生平衡也起到了重要作用。 果膠酶按其作用方式的不同可分為兩大類，即酯酶和解聚酶，而解聚酶又分為水解酶和裂解酶。水解酶是通過引入水分子水解糖苷鍵，而裂解酶是通過反式消去作用，斷裂糖苷鍵。果膠酶是目前工業(yè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，可以應(yīng)用于各種行業(yè)，在果汁制造和造紙工業(yè)中的應(yīng)用最為常見，近些年，逐漸開始應(yīng)用于釀酒、飼料制造、紡織行業(yè)中。 我們以來源于嗜熱菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的果膠酶系（4株果膠酶）為研究對(duì)象，重點(diǎn)對(duì)重組果膠水解酶CbPelA、果膠裂解酶CbPelC的基本性質(zhì)進(jìn)行表征。并設(shè)計(jì)突變體，研究CbPelC中結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系。 本課題組從Caldicellulosiruptor bescii DSM6725中獲得四個(gè)果膠酶基因CbPelA（E.C.3.2.1.67）、CbPelB、CbPelC（E.C.4.2.2.2）及CbPelD（E.C.4.2.2.9）。通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CbPelA-D，連接到載體pET-20b(+)上，并分別轉(zhuǎn)入E. coliorigami (DE3)、E. coli BL21(DE3)感受態(tài)，構(gòu)建了Caldicellulosiruptor besciiDSM6725果膠酶系的原核表達(dá)體系。經(jīng)Blsat序列比對(duì)分析果膠水解酶CbPelA（E.C.3.2.1.67）、果膠裂解酶CbPelC（E.C.4.2.2.2），與已報(bào)道的同家族果膠酶氨基酸序列同源性分別最高為46%和54%，都具有新型果膠酶基因。采用熱處理和鎳離子親和層析法對(duì)CbPelA、CbPelC進(jìn)行純化，分別得到約50kD，46kD大小的蛋白條帶，與理論預(yù)測結(jié)果一致。酶學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，該兩株梅的最適溫度分別為72℃，70℃，最適pH分別為5.2和9.5。通過DNS法和235nm最大吸收法分別檢測該兩株果膠酶的活力，由于兩株酶的作用機(jī)理不同，檢測手段也不同，CbPelA只能通過DNS還原糖檢測法來測定活力，CbPelC可以通過不飽和雙鍵在235nm存在最大吸收法，來測定其活力，這也證實(shí)了CbPelC的裂解酶作用機(jī)理�；盍y定CbPelA最大反應(yīng)速率為386.8U/mg-1，而CbPelC的催化結(jié)構(gòu)域比活力達(dá)到3000U mg-1以上。迄今為止，CbPelC及其催化結(jié)構(gòu)域CbPelC-CD的活力遠(yuǎn)高于已報(bào)道的其它第三家族的果膠酶。兩株酶都具有良好的熱穩(wěn)定性，半衰期分別長達(dá)14h，，10h。薄層層析和粘度系數(shù)下降實(shí)驗(yàn)證實(shí)前者為外切酶，后者為內(nèi)切酶。底物特異性研究實(shí)驗(yàn)顯示，隨著底物酯化度的升高，酶的活力逐漸降低。底物酯化度20-34%時(shí)，CbPelC的活力與以多聚半乳糖醛酸為底物時(shí)沒有明顯差異。兩株果膠酶活性只特異性針對(duì)多聚半乳糖醛酸，對(duì)CMC、Avicel、葡聚糖、木聚糖、殼聚糖、可溶性淀粉等其他多糖類皆沒有活力。一價(jià)離子Na+、K+、NH4+對(duì)酶促反應(yīng)影響較�。淮蠖鄶�(shù)二價(jià)金屬離子Mg2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Ni2+都對(duì)CbPelA的酶促反應(yīng)有不同程度的抑制，其中Cu2+，Cd2+完全抑制CbPelA酶活力。CbPelC酶表現(xiàn)為Ca2+完全依賴性，沒有Ca2+存在時(shí)，CbPelC沒有活力，Ca2+濃度0.8mM-1.0mM時(shí)，酶活力達(dá)到最大值。 CbPelC、CbPelD的結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)未知功能結(jié)構(gòu)域，并且沒有類似報(bào)道，我們以CbPelC為例，通過設(shè)計(jì)兩個(gè)突變體，探討野生型CbPelC和突變體CbPelC-CA、CbPelC-CD三者之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該未知功能結(jié)構(gòu)域與鈣離子結(jié)合、與可溶底物多聚半乳糖醛酸鏈的結(jié)合及與體外其他多糖的結(jié)合均無關(guān)系，而在結(jié)合不可溶生物質(zhì)底物時(shí)，具有重要的作用。 綜上所述，本課題成功獲得Caldicellulosiruptor bescii DSM6725果膠酶系的四株新型嗜熱果膠酶，其中CbPelA、CbPelC具有較高的酶活力和優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，突變體的設(shè)計(jì)有助于我們更深入的理解其結(jié)構(gòu)域的功能和催化機(jī)理。這項(xiàng)工作對(duì)今后繼續(xù)探究有效利用生物質(zhì)能源具有重要的意義，為其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411

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本文編號(hào)：2625357