【摘要】：目的:采用甲型H1N1流感病毒鼠肺適應(yīng)株P(guān)R8構(gòu)建流感模型,通過MENK預(yù)防性和治療性兩種方式作用于感染流感病毒PR8的巨噬細(xì)胞RAW264.7體外實(shí)驗(yàn),以及MENK作用于感染流感病毒PR8的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),以Toll樣受體為切入點(diǎn)探討MENK體內(nèi)外對流感病毒感染的免疫調(diào)節(jié)作用及調(diào)控機(jī)制,為MENK作為新型通用型流感疫苗(或疫苗佐劑)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù),為臨床流感病毒的防治提供新策略。研究方法:1、MENK調(diào)控RAW264.7細(xì)胞抗流感病毒PR8感染。雞胚培養(yǎng)對流感病毒PR8進(jìn)行增毒,血凝試驗(yàn)(HA)檢測病毒滴度,計(jì)算病毒TCID_(50)并以100TCID_(50)的病毒劑量感染RAW264.7細(xì)胞,通過MENK預(yù)防性和治療性給藥的方式進(jìn)行干預(yù)。MTS檢測MENK最佳作用濃度;光學(xué)顯微鏡和Hoechst染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞胞內(nèi)Influenza NP和NF-κB p65的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光染色對細(xì)胞Influenza NP,NF-κB p65,MOR表達(dá)定位;q PCR法檢測Virus、TLR4、TLR7、NF-κB p65、MOR mRNA水平。2、MENK調(diào)控感染流感病毒PR8小鼠固有免疫應(yīng)答作用。采用6~8周C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為正常對照組、流感病毒(PR8)模型對照組、MENK預(yù)防組,MENK治療組,利巴韋林對照組。用10 LD_(50)病毒劑量感染小鼠,連續(xù)觀察14天,記錄小鼠體重及生存時(shí)間。于感染后第4天取材,對小鼠體內(nèi)免疫相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。包括:肺組織的大體形態(tài)和肺HE染色;血凝試驗(yàn)(HA)測肺組織病毒滴度;組織免疫熒光法對肺組織Influenza-NP蛋白定位;q PCR檢測肺組織IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6、IL-1β和Virus mRNA水平;Western blot、qPCR和免疫組織化學(xué)染色法檢測阿片受體MOR、DOR,Toll受體通路相關(guān)因子TLR7、MyD88、TRAF6和NF-κB p65表達(dá)。3、MENK調(diào)控感染流感病毒PR8小鼠適應(yīng)性免疫應(yīng)答作用。采用6~8周C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為正常對照組、流感病毒(PR8)模型對照組、MENK預(yù)防組,MENK治療組。用2LD_(50)病毒劑量感染小鼠,于感染后第10天取支氣管肺泡灌洗液、肺組織和淋巴結(jié),制備單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞術(shù)檢測支氣管肺泡灌洗液、肺組織和淋巴結(jié)中CD4~+T、CD8~+T、CD4~+IFN-γ、CD8~+IFN-γ、CD4~+T_(EM)和CD8~+T_(EM)細(xì)胞,并用PMA/ionomycin,influenza NP(366-374),influenza PA(224-233)刺激支氣管肺泡灌洗液、肺組織和淋巴結(jié)細(xì)胞,檢測效應(yīng)性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)及NP/PA特異性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)細(xì)胞。結(jié)果:1、MENK調(diào)控RAW264.7細(xì)胞抗流感病毒PR8感染的研究。流感病毒PR8經(jīng)雞胚分離培養(yǎng)后,病毒滴度由培養(yǎng)前的HA 1:32增加到1:512,100TCID_(50)/50μl=1:28.2。MENK 20~10~(-7)mg/ml均能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖,在濃度為10mg/ml、1mg/ml、10~(-1)mg/ml和10~(-2)mg/ml時(shí)與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且10mg/ml為最佳作用濃度。MENK預(yù)防組和MENK治療組在感染病毒24h、48h、72h時(shí),RAW264.7細(xì)胞凋亡減少。鏡下顯示PR8感染RAW264.7細(xì)胞后,形態(tài)由圓形、類圓形向不規(guī)則形轉(zhuǎn)變,胞質(zhì)內(nèi)多有空泡和顆粒狀物質(zhì)出現(xiàn)。MENK預(yù)防和治療組細(xì)胞呈長梭形且多伴偽足,偶有空泡和顆粒狀物質(zhì)出現(xiàn)。Hoechst染色顯示正常組RAW264.7細(xì)胞的胞核呈暗藍(lán)色,而PR8組出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,胞核呈致密濃染、亮藍(lán)色。MENK預(yù)防組和治療組偶有或少量伴有細(xì)胞核呈碎點(diǎn)樣濃染。流式細(xì)胞術(shù)、qPCR和免疫熒光染色顯示MENK預(yù)防組和治療組較比PR8組均能下調(diào)Influenza NP蛋白表達(dá)及上調(diào)NF-κB p65水平(P0.05)。RAW264.7細(xì)胞感染流感病毒48h后TLR4 mRNA表達(dá)量小幅上調(diào)(P0.05);MENK預(yù)防組和治療組均能上調(diào)TLR4 mRNA水平(P0.05);四組細(xì)胞TLR7 mRNA表達(dá)量無明顯變化(P0.05)。RAW264.7細(xì)胞在感染PR8后MOR mRNA的表達(dá)無明顯變化(P0.05),MENK預(yù)防組和治療組受體表達(dá)上調(diào),顯著高于正常對照組和病毒對照組(P0.01)。2、MENK調(diào)控感染流感病毒PR8小鼠固有免疫應(yīng)答的研究。MENK預(yù)防性和治療性給藥能緩解PR8感染所致的小鼠體重降低,延長小鼠生存時(shí)間,且Pre-MENK組小鼠存活率高于MENK組。肺組織的大體形態(tài)和HE染色顯示,PR8組肺組織出現(xiàn)廣泛的組織實(shí)變和細(xì)支氣管炎癥、氣道上皮壞死、炎性細(xì)胞浸潤、彌漫性肺泡損傷伴水腫和出血;Pre-MENK組僅有輕微細(xì)支氣管和肺泡炎性細(xì)胞浸潤;Pre-MENK,MENK和Rib組與PR8組相比肺組織病理改變減輕,MENK組肺組織損傷程度(44.59%)高于Pre-MENK(23.22%)。血凝試驗(yàn)(HA)、q PCR、流感病毒NP免疫熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示,MENK預(yù)防性和治療性給藥可有效降低小鼠肺組織的病毒滴度,且預(yù)防性用藥效果更明顯。qPCR結(jié)果顯示,MENK可顯著降低IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá),減輕炎癥介質(zhì)失衡引起的肺組織病理損傷。MENK預(yù)防給藥和治療給藥后小鼠肺組織阿片受體(MOR,DOR)上調(diào),而PR8組和Rib治療組與正常對照組比較受體表達(dá)量無明顯變化(P0.05)。Western blot、qPCR和組化定位結(jié)果顯示,PR8組TLR7,MyD88,TRAF6和NF-κB p65的表達(dá)水平明顯升高,MENK預(yù)防性和治療性給藥均能降低其表達(dá)水平(P0.05)。3、MENK對感染流感病毒PR8小鼠適應(yīng)性免疫應(yīng)答的研究。Pre-MENK組支氣管肺泡灌洗液和肺組織CD8~+T細(xì)胞比例較比PR8組明顯升高(P0.05);MENK組肺組織中CD8~+T細(xì)胞比例較比PR8組增加(P0.05);Pre-MENK組和MENK組淋巴結(jié)CD4~+、CD8~+T細(xì)胞比例較比PR8組有不同程度的上調(diào),但差異不顯著(P0.05);Pre-MENK組支氣管肺泡灌洗液和肺組織CD4~+IFN-γ、CD8~+IFN-γ細(xì)胞比例較比PR8組明顯升高(P0.05),而MENK組支氣管肺泡灌洗液、肺組織和淋巴結(jié)中各細(xì)胞雖有不同程度的增加,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);Pre-MENK組支氣管肺泡灌洗液和肺組織CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)細(xì)胞比例及淋巴結(jié)中CD4~+T_(CM)、CD8~+T_(CM)比例較比PR8組呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)(P0.01),而淋巴結(jié)CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)細(xì)胞比例無明顯變化(P0.05);MENK組支氣管肺泡灌洗液、肺組織和淋巴結(jié)中CD4~+T_(CM)、CD8~+T_(CM)、CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)細(xì)胞比例較比PR8組有所增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);Pre-MENK組支氣管肺泡灌洗液和肺組織效應(yīng)性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)及NP/PA特異性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)細(xì)胞比例較PR8組顯著增加(P0.01);MENK組支氣管肺泡灌洗液、肺組織和淋巴結(jié)中效應(yīng)性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)及NP/PA特異性CD4~+T_(EM)、CD8~+T_(EM)細(xì)胞比例與PR8組比較呈上升趨勢,但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1、MENK通過上調(diào)阿片受體MOR,正向調(diào)控TLR4-NF-κB p65信號(hào)通路,增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞抗病毒效應(yīng)。2、MENK通過下調(diào)TLR7-MyD88-NF-κB p65信號(hào)通路,抑制流感所致的過度免疫應(yīng)答和急性肺損傷,預(yù)防性給藥效果更明顯。3、MENK能上調(diào)機(jī)體對病毒的特異性T細(xì)胞應(yīng)答和針對病毒保守表位的免疫記憶。
【圖文】：

3.1雞胚培養(yǎng)PR8的滴度紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）結(jié)果顯示流感病毒PR8經(jīng)雞胚分離培養(yǎng)后，病毒滴度由培養(yǎng)前的HA1:32增加到1:512。見圖1.1。圖1.1 雞胚培養(yǎng)流感病毒后的病毒滴度Fig.1.1 Influenza virus titer by chicken embryo culture3.2流感病毒TCID50病毒組織細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）是病毒感染能力的標(biāo)化指標(biāo)，，根據(jù)Reed和Muench方法對HA進(jìn)行計(jì)算，見圖1.2、表1.2。100TCID50/50μl=1:28.2。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文10圖1.2 流感病毒TCID50（HA實(shí)驗(yàn)）Fig.1.2 Hemagglutination test detected influenza virus TCID50表 1.2 Reed-Muench 方法計(jì)算 TCID50滴度的病毒稀釋度配比情況Tab.1.2 Dilution ratio of the virus TCID50using Reed-Muench method稀釋度 陽性數(shù)目陰性數(shù)目陽性數(shù) 陰性數(shù) 比率陽性數(shù)百分比(%)10-24 0 11 0 11/11 10010-2.54 0 7 0 7/7 10010-33 1 3 1 3/4 7510-3.50 4 0 5 0/5 03.3MENK對RAW264.7最佳作用濃度不同濃度的MENK分別作用于RAW264.7細(xì)胞48h，MTS結(jié)果表明：MENK20～10-7mg/ml均能促進(jìn)細(xì)胞增殖，在濃度為 10mg/ml 、1mg/ml、10-1mg/ml 和10-2mg/ml與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且在10mg/ml時(shí)到達(dá)峰值，之后隨濃度的降低促進(jìn)增殖作用減弱, 見圖1.3(a)。采用對RAW264.7細(xì)胞增殖作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的MENK濃度作用于感染流感病毒PR8的細(xì)胞，MTS結(jié)果顯示：隨著病毒感染時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）；MENK預(yù)防組和MENK治療組在感染病毒24h、48h、72h時(shí)，10mg/ml、1mg/ml均能提高細(xì)胞的增殖率
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965;R-332

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本文編號(hào)：2624791