發(fā)布時(shí)間：2020-04-11 22:11

【摘要】：研究背景人感染H7N9禽流感病毒于2013年在我國(guó)首次分離,2016年10月在我國(guó)東南沿海地區(qū)再次出現(xiàn),形成了第五次流行波。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)顯示,截至2017年12月,此次流行發(fā)病人數(shù)達(dá)767人,死亡報(bào)道292人,死亡率約38.1%。面對(duì)這種突發(fā)的新亞型流感病毒,至今缺乏有效的保護(hù)性疫苗。臨床一線抗病毒藥物早期雖能抑制病毒復(fù)制,但感染后期療效不明顯,且有報(bào)道臨床已產(chǎn)生了耐藥株。最近有研究分析表明病毒血凝素鏈接肽位置發(fā)生了插入性突變,使得H7N9從低致病性禽流感病毒(LPAIV)突變?yōu)楦咧虏⌒郧萘鞲胁《?HPAIV)。隨著病毒的不斷變異,有引起新一輪流感大流行的潛在可能。新的預(yù)防和治療應(yīng)對(duì)策略迫在眉睫。面對(duì)新突發(fā)的傳染性疾病,抗病毒治療依賴于從已有的藥物中篩選或廣譜抗病毒藥物的研發(fā)。單克隆抗體可高效的中和病毒,發(fā)揮抗病毒作用。目前抗體篩選常用的技術(shù)有細(xì)胞雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、B細(xì)胞永生化技術(shù)和單細(xì)胞PCR技術(shù)。近年來(lái)隨著單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)的成熟,其全人源、高效率、高特異性、抗體天然配對(duì)等優(yōu)點(diǎn),使其在抗體制備領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用,成為快速應(yīng)對(duì)新突發(fā)傳染性疾病重要手段。第一部分人感染H7N9病毒誘導(dǎo)宿主HA抗體產(chǎn)生的特異性及交叉反應(yīng)研究目的探討人感染H7N9宿主血清HA抗體的產(chǎn)生及與其他HA亞型的交叉反應(yīng)特性,為廣譜中和抗體的篩選及疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。研究方法合成各亞型HA蛋白胞外域核苷酸序列,并克隆到改造過(guò)的pCDNA3.1載體上構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá)C端帶標(biāo)簽的H1,H3,H5和H7重組HA蛋白。用抗標(biāo)簽的抗體捕獲293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清中的HA蛋白,建立ELISA法。用建立的ELISA法檢測(cè)22例34份H7N9感染者血清抗體與蛋白H1、H3、H5、H7(2013)和H7(2017)的結(jié)合反應(yīng),同時(shí)設(shè)H1N1感染組及健康對(duì)照組。研究結(jié)果1.重組HA蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)成功構(gòu)建了A/Shanghai/1/2013(H7N9)、A/Guangdong/HP001/2017(H7N9)、H1N1、H3N2和H5N1病毒株HA蛋白表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)序列分析驗(yàn)證的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)HA重組蛋白,Western blot分析蛋白條帶大約在72~100KD。2.血清抗體特異性和交叉反應(yīng)22例34份H7N9感染血清對(duì)2013年的LPAI和2017年的HPAI H7N9禽流感病毒的HA蛋白均有顯著結(jié)合(與健康對(duì)照組比較P0.01,與H1N1組比較P0.01)。同時(shí)血清抗體與組1的H1、H5(與健康對(duì)照組比較P0.01)及組2的H3有交叉反應(yīng)(與健康對(duì)照組比較P0.05)。結(jié)論1.采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系成功表達(dá)流感病毒重組HA蛋白,并建立了可用于血清抗體檢測(cè)的捕獲ELISA法。2.人感染H7N9病毒可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的抗體反應(yīng),且對(duì)2013年LPAI分離株和2017年HPAI分離株均有結(jié)合反應(yīng)。3.人感染H7N9病毒可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生與其他亞型HA蛋白(組1的H1、H5,組2的H3)的交叉反應(yīng),為廣譜中和抗體的篩選及疫苗的研發(fā)提供了依據(jù)。第二部分人感染H7N9病毒HA特異的單克隆抗體的分離及特性鑒定研究目的從H7N9感染者體內(nèi)篩選出抗HA的高親和力中和性抗體,為流感疫苗的研制提供重要的靶點(diǎn),同時(shí)為臨床藥物治療提供可能的手段。研究方法分離H7N9感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞,流式分選出記憶B細(xì)胞(IgD-IgM-CD27+CD38low),經(jīng)培養(yǎng)后,采用捕獲H7抗原ELISA法篩選B細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體分泌,收集陽(yáng)性孔所對(duì)應(yīng)的B細(xì)胞沉淀,應(yīng)用單細(xì)胞PCR技術(shù)克隆抗體重、輕鏈可變區(qū)基因,分別連接到相應(yīng)的重、輕鏈載體上,構(gòu)建抗體重鏈和輕鏈表達(dá)質(zhì)粒,并進(jìn)行體外表達(dá)獲得抗體。進(jìn)而應(yīng)用生物膜層干涉技術(shù)(BLI)檢測(cè)抗體的親和力;用建立的ELISA法檢測(cè)抗體與蛋白H7(2013)、H7(2017)的結(jié)合反應(yīng);通過(guò)ELISA法檢測(cè)抗體與HA蛋白截短片段(HA1、HA2和去球部HA)結(jié)合反應(yīng),結(jié)合抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行初步探索;并采用病毒微量中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體中和病毒的能力。研究結(jié)果1.抗體的分離和親和力測(cè)定流式分選出的記憶B細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后,用捕獲H7抗原ELISA法篩出12個(gè)陽(yáng)性孔。收集陽(yáng)性孔所對(duì)應(yīng)的B細(xì)胞沉淀,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,經(jīng)2輪PCR擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,獲得8對(duì)配對(duì)的輕鏈和重鏈目的條帶,大小為350bp左右。產(chǎn)物經(jīng)膠回收,分別連接到相應(yīng)的重鏈和輕鏈載體上,最后成功構(gòu)建5株抗體表達(dá)質(zhì)粒,分別命名為:6C3、1-2、19B2、23B7、24D6。5株抗體與HA抗原均有很強(qiáng)結(jié)合活性,其親和力(KD)在1nM~12nM之間。2.抗體的特異性與交叉反應(yīng)5株抗體對(duì)2013年LPAI分離株和2017年HPAI分離株均有明顯的結(jié)合;抗體6C3、19B2、23B7、24D6與蛋白H1、H3、H5無(wú)交叉反應(yīng);抗體1-2與組2的H3有交叉反應(yīng),而與組1的H1、H5無(wú)交叉反應(yīng)。3.抗體與病毒HA結(jié)合位點(diǎn)的分析抗體6C3、19B2、23B7、24D6與HA、HA1有明顯結(jié)合,而與HA2、去球部HA無(wú)結(jié)合;抗體1-2與HA、HA2、去球部HA有明顯結(jié)合,而與HA1無(wú)結(jié)合�？贵w競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抗體1-2與抗體6C3、19B2、23B7、24D6無(wú)競(jìng)爭(zhēng);抗體6C3與抗體1-2無(wú)競(jìng)爭(zhēng),與抗體19B2、23B7、24D6競(jìng)爭(zhēng);抗體19B2與1-2、23B7、24D6無(wú)競(jìng)爭(zhēng),與抗體6C3競(jìng)爭(zhēng);抗體23B7與1-2、19B2無(wú)競(jìng)爭(zhēng),與抗體6C3、24D6競(jìng)爭(zhēng);抗體24D6與1-2、19B2無(wú)競(jìng)爭(zhēng),與抗體6C3、23B7競(jìng)爭(zhēng)。4.抗體的中和活性病毒微量中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抗體6C3、19B2、23B7、24D6對(duì)LPAI和HPAI H7N9禽流感病毒均有明顯的中和活性(對(duì)LPAI株IC_(50)分別為0.05742、4.832、0.7157和2.051μg/ml;對(duì)HPAI株IC_(50)分別為0.2718、1.006、0.9995和3.442μg/ml),且對(duì)病毒的中和活性具有濃度依賴性,隨著抗體濃度的增加,病毒感染率明顯下降。結(jié)論1.應(yīng)用B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),成功從H7N9感染者體內(nèi)分離出5株HA特異的高親和力單克隆抗體;2.獲得的5株抗體對(duì)LPAI和HPAI株HA蛋白均有明顯結(jié)合反應(yīng);3.抗體1-2與其他亞型HA蛋白有交叉結(jié)合,抗體6C3、19B2、23B7、24D6與其他亞型HA蛋白無(wú)結(jié)合;抗體1-2的結(jié)合部位可能位于HA莖部,抗體6C3、19B2、23B7、24D6很可能結(jié)合于HA頭部,且抗體23B7、24D6結(jié)合位點(diǎn)相同,抗體6C3結(jié)合位點(diǎn)跨域最廣;4.體外中和實(shí)驗(yàn)揭示抗體6C3、19B2、23B7、24D6對(duì)H7N9禽流感病毒LPAI和HPAI株均有明顯中和活性,其中抗體6C3的中和活性最強(qiáng),有望成為治療性抗體的候選者。
【圖文】：

圖 1 HA 胞外域 PCR 產(chǎn)物電泳圖g.1 The electrophoregram of PCR prodouSB/01/2009(H1N1)、A/Guangd和 A/Guangdong/HP001/2017(H7N經(jīng)密碼子優(yōu)化后由通用生物公司載體 pcDNA3.1 上，經(jīng)序列分析

圖 3 H1N1、H3N2、H5N1 及 H7N9 重組 HA 蛋白 Western blysis of recombinant H1N1,H3N2,H5N1 and H7N9 HAproteins b特異性和交叉反應(yīng)究 H7N9 禽流感病毒誘導(dǎo)宿主特異抗體的產(chǎn)生情況。SA 法首先檢測(cè)分析 34 份人感染 H7N9 禽流感病毒患9 禽流感病毒和 2017 年 HPAI H7N9 禽流感病毒的 H
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2623897